利用发酵和催化相结合的方法制备己二酸和己二酸盐的替代合成路径的制作方法
【专利说明】利用发酵和催化相结合的方法制备己二酸和己二酸盐的替 代合成路径
[0001] 序列表
[0002] 本申请包含序列表，已通过EFS-Web提交了 ASCII格式文本，并通过整体引用的方 式包含于本申请中。所述ASCII副本，创制于2013年9月10日，名称为DNP-10-1205W0_ SL. txt，文件大小为9164字节。
技术领域
[0003] 本申请涉及制备己二酸盐和己二酸的方法。
【背景技术】
[0004] 目前，许多含碳的化学物质都源自于石油资源。依赖于石油资源的化学原料导致 石油资源的枯竭以及与石油钻探相关的不良环境影响。
[0005] 通过糖发酵获得的某些碳质产品有望替代源于石油的化学原料，用于制造含碳的 化学物质。上述碳质产品包括己二酸和己二酸盐。
[0006] 在目前石油源化学原料主导的工业生产领域中，己二酸具有很大的市场空间，如 3-酮己二酸盐、3-羟基己二酸盐和己烯二酸盐的己二酸盐也可用作生产许多功能性二酸 的前体物质。
【发明内容】
[0007] 我们提供了一种制备己二酸或己二酸盐的方法，包括以下步骤：a)缩合α -酮戊 二酸盐与乙酰辅酶A制得高柠檬酸盐；b)通过至少一个化学反应使高柠檬酸盐转化为己二 酸盐或己二酸；以及c)可选地，分离己二酸盐或己二酸。
[0008] 我们还提供了一种制备己二酸或己二酸盐的方法，包括以下步骤：a)准备高柠檬 酸盐；b)高柠檬酸盐脱羧基制得3-酮己二酸盐；以及c)直接或通过选自3-羟基己二酸盐 和己烯二酸盐中的至少一种中间产物转化3-酮己二酸盐制得己二酸或己二酸盐。
[0009] 我们还提供了一种制备己二酸酯的方法，包括以下步骤：a)准备高柠檬酸盐；b) 高柠檬酸盐脱羧基制得3-酮己二酸盐；c) 3-酮己二酸盐转化为3-酮己二酸酯；d)直接或 通过选自3-羟基己二酸酯和己烯二酸酯中的至少一种中间产物转化3-酮己二酸酯制得己 二酸酯；以及e)可选地，将己二酸酯转化为己二酸。
[0010] 我们进一步提供了一种制备己二酸盐或其酸的方法，包括以下步骤：a)准备 高柠檬酸盐；b)处理高柠檬酸盐制得高柠檬酸内酯；c)高柠檬酸内酯脱氢制得4-羧 基-粘康酸内酯；d) 4-羧基-粘康酸内酯脱羧基制得5-甲酯基-丁内酯_4_烯 (5-carbomethoxy-GBL-4_ene) ;e) 5-甲酯基-丁内酯-4-烯互变异构制得3-酮己二酸盐； 以及f)可选地，将3-酮己二酸盐转化为己二酸盐或己二酸。
【附图说明】 toon] 图1示意性说明由高柠檬酸盐制备己二酸盐和己二酸的合成路径。
[0012] 图2示意性说明将高柠檬酸盐经高柠檬酸内酯转化为己二酸或己二酸盐。
[0013] 图3为质粒PBA006的示意图，该质粒包含大肠杆菌密码子优化的高柠檬酸合酶 (nifV)和高异柠檬酸脱氢酶（aksF_Mm)基因。
[0014] 图4为质粒PBA066的示意图，该质粒包含大肠杆菌密码子优化的高柠檬酸合酶 (nifV)和高异柠檬酸脱氢酶（aksF_C5)基因。
[0015] 图5为与对照细胞（BL21)相对比，高柠檬酸合酶在BA066原溶解产物中的活性结 果。
[0016] 图6为与对照细胞（BL21)相对比，经质粒pBA066转导的BA066细胞溶解产物中 不溶部分和可溶部分的SDS-PAGE电泳结果。
【具体实施方式】
[0017] 与多步骤的生化途径相比，结合生物学和热化学方法制备化工原料是一种更为快 捷和经济的途径。该途径经常能够获得具有商业价值的中间产物。上述方法可应用于制备 己二酸、己二酸盐和己二酸酯。例如，我们提供了一些利用高柠檬酸盐和3-酮己二酸盐作 为初始化合物和/或化学中间体的化学途径和生化途径。
[0018] 公开的生化途径可包括一种或多种蛋白质或酶的活性，尤其是异源性酶，该蛋白 质或酶可催化反应使反应底物转化为产品或中间产物。利用本领域现有的技术可修饰微生 物使其表达一种或多种蛋白质或酶。相应的，我们提供了工程代谢途径、分离核酸或工程核 酸、多肽或工程多肽、宿主细胞或基因工程宿主细胞、由碳源制得目标化合物或中间产物的 方法以及原料。
[0019] 适合作为本发明生物合成途径起始点的碳源包括碳水化合物和合成中间体。例如 细胞能够代谢的碳水化合物包括糖类，如葡萄糖、葡聚糖、甘油三酯和脂肪酸。代谢途径的 中间产品，如2-酮戊二酸盐也可用作起始物。
[0020] 本领域的技术人员应当理解，在此示例的工程路径是相对于，但并不限于，菌种的 特定基因并包括核酸或氨基酸序列的同源染色体或同源基因。当利用本领域已知方法进行 比对时，同源染色体和同源基因序列拥有高度的序列一致性/相似性。
[0021] 本发明的方法和微生物的特征涉及"基因修饰"或重组的微生物或宿主细胞，所述 微生物或宿主细胞经过工程改造而具有新的代谢功能或新代谢途径。此处使用的术语"基 因修饰"的微生物包括具有至少一种基因改变的微生物，例如重组基因的表达，而在引用的 菌种的野生株中通常不存在这种基因改变。在一些实施例中，将基因工程微生物在代谢途 径的关键点上进行工程改造来表达或过度表达至少一种特定酶，和/或抑制或限制其他酶 的活性，以克服或避免代谢瓶颈。
[0022] 我们提供了基因修饰宿主细胞或微生物，以及利用其由α -酮酸制备己二酸和己 二酸盐的方法。此处所述的"宿主细胞"是指真核细胞、原核细胞或来源于作为单细胞实体 进行培养的多细胞生物（如细胞系）的细胞。所述宿主细胞可以是原核的（如细菌如大肠 杆菌或枯草芽孢杆菌）或真核的（如酵母菌、哺乳动物或昆虫细胞）。例如，宿主细胞可以 是细菌细胞（如大肠杆菌，枯草芽孢杆菌，分支杆菌，结核分支杆菌，或其他合适的细菌细 胞），古生菌（例如甲烷球菌或海藻甲烷球菌或其他合适的古细胞），酵母菌细胞（例如酵 母属菌种，如啤酒酵母、粟酒裂殖酵母、Picchia酵母，念珠菌属如白色念珠菌，或其他合适 的酵母菌种）。优选宿主细胞包括大肠杆菌。
[0023] 代谢工程细胞可通过向宿主细胞中转导入至少一种编码包含在工程代谢途径中 的酶的核苷酸序列来获得。此处所述"核苷酸序列"、"核酸序列"和"遗传结构"可相互替 换使用，并且表示RNA或DNA的聚合体，单链或双链，可选地包含合成的、非天然的或经改变 的核苷酸碱基。核苷酸序列可包含一个或多个cDNA、基因组DNA、合成DNA或RNA的片段。
[0024] 在优选实施例中，编码代谢过程中的酶或蛋白质的核苷酸序列是经过密码子优化 的，从而反映宿主细胞的典型的密码子选择而不改变通过核苷酸序列编码的多肽。在优选 实施例中，术语"密码子优化"或者"密码子优化的"是指修饰核酸序列的密码子内容，而不 修饰该核酸编码的多肽序列，以增强在特定宿主细胞中的表达。在优选实施例中，该术语旨 在包含通过修饰核酸序列的密码子内容的方法来控制多肽的表达水平（如提高或降低表 达水平）。
[0025] 在一些实施例中，代谢工程细胞可表达一种或多种具有酶活性的多肽,而这些酶 活性是实施下述步骤所必须的。比如，特定细胞可包含一、二、三、四、五或更多个核酸序列， 每个核酸序列都编码相应的多肽，这些多肽都是反应途径中由底物向产品转化过程中所必 须的，如由α-酮戊二酸盐或高柠檬酸盐转化为己二酸或己二酸盐的反应途径。或者，单独 的核酸分子可编码一个或多个多肽。例如，单独的核酸分子可包含能够编码二、三、四个或 更多不同多肽的核酸序列。
[0026] 用于在此描述的方法和微生物的核酸序列可从不同来源获得，例如，cDNA序列的 扩增，DNA信息库，全程合成，和/或一个或多个基因组片段的切除。然后将从上述来源获 得的序列利用标准分子生物学和/或重组DNA技术进行修饰从而制备具有期望变异的核酸 序列。核酸序列的示例性修饰方法包括，例如，定向诱变，PCR突变形成，切除，嵌入，置换， 利用限制性内切酶对序列进行内部切换，与绑定点选择性结合，同源重组，位点特异性重组 或其不同组合。在其他实例中，核酸序列可以是合成的核酸序列。合成多核苷酸序列可通 过许多方法制得，这些方法在美国专利7, 323, 320中有详细叙述，相关的主题以整体引用 的方式包含于本申请中。
[0027] 转化细菌、植物和动物细胞的方法是已知的。常用的细菌转化方法包括电穿孔和 化学修饰。
[0028] 通过化学途径，利用本领域已知的技术可对化学产品进行分离和处理。
[0029] 在本领域中众所周知，己二酸盐能够很容易的转化为己二酸，反过来，己二酸也能 够轻易的转化为己二酸盐。因此，可以理解，术语"己二酸盐"和术语"己二酸"是可以替换 使用的，在此处，二者可以轻易的相互转化或替代对方。同样的，本申请中所提及的其他具 有酸和盐形式的化合物，描述其酸和盐形式的术语也是可以替换使用的。因此，例如，本领 域技术人员能够理解一个反应途径的中间产物或产品为一种化合物的酸，则该反应途径也 同样可以用于制备该化合物的盐。
[0030] 图1所示为由2-酮戊二酸盐生物合成己二酸和己二酸盐的示例性生物和/或 化学途径。利用生物技术能够容易的制备高柠檬酸盐（图1中步骤Α)。高柠檬酸合酶 (EC2. 3. 3. 14)催化化学反应：乙酰辅酶Α+Η20+2-酮戊二酸盐〇高柠檬酸盐+辅酶Α。所得产 品，高柠檬酸盐，也被称为（R) -2-羟基丁烷-1，2, 4-三羧酸盐。
[0031] 例如，高柠檬酸合酶askA可从甲烷球菌得到。甲烷球菌是一种嗜热产甲烷菌，该 菌中的辅酶B途径要求的温度条件为50-60°C。因此，来源于甲烷球菌的酶，如高柠檬酸合 酶askA，在50-60°C左右的高温条件下具有峰值效率。然而，也可以使用来源于在较低温度 条件下增值的其他产甲烷菌的替代AksA蛋白同系物。
[0032] 在一些优选实施例中，高柠檬酸盐的合成可以被高柠檬酸合酶NifV或NifV 同系物所催化。NifV的同系物存在于多种生物体中，包括但不限于，棕色固氮菌， 肺炎杆菌，圆褐固氮菌，弗兰克氏菌（strain FaCl),鱼腥藻（strain PCC 7120)，巴 西固氮螺菌，巴氏梭菌，球形红细菌，荚膜红细菌，弗兰克氏菌，carboxyldothermus hydrogenoformans(strain Z-2901/DSM 6008)，项圈藻（strain PCC 7120)，聚团肠杆 菌，欧文氏菌亚种· Atroseptica(Pectobacterium atrosepticum)，绿硫菌，固氮弧菌属 (strain BH72)，磁螺菌，慢生根瘤菌（strain 0RS278)，慢生根瘤菌（strain BTAi 1/ATCC BAA-1182)，克氏梭菌（strain ATCC 8527/DSM 555/NCMB 10680)，克氏梭菌（strain ATCC 8527/DSM 555/NCMB 10680)，丁酸梭菌5521，台湾贪铜菌（strain R1/LMG 19424)，台湾罗 尔斯通菌（strain LMG 19424)，肉毒杆菌（strain Eklund 17B/type B)，肉毒杆菌（strain Alaska E43/type E3)，聚球藻属（strain JA-2-3B'a(2-13))(黄石B-Prime蓝藻细菌），聚 球藻属（strain JA-3-3Ab)(黄石A-Prime蓝藻细菌），嗜铁土壤细菌和运动发酵单胞菌。 在优选实施例中，高柠檬酸合酶为来源于棕色固氮菌的NifV，其可包含根据SEQ ID NO: 1 的氨基酸序列。
[0033] 在另一些优选实施例中，高柠檬酸合酶为来源于棕色固氮菌的NifV，并由根据SEQ ID NO :2的核苷酸序列编码，并经过了在大肠杆菌中的密码子优化表达。在另一些实施例 中，反应途径的第一步骤被设计为经高朽1檬酸合酶Lys 20或Lys 21催化。Lys 20和Lys 21是两种与啤酒酵母中赖氨酸生物合成途径的第一步骤相关联的高柠檬酸合酶同工酶。 Lys 20或Lys 21同系物存在于多种生物体中，如树干毕赤酵母和嗜热细菌中。
[0034] 在一些实施例中，在以乙酰辅酶A和α-酮酸作为底物的反应中，用于催化使 α-酮戊二酸转化为高柠檬酸的酶（如EC 2.3.3)可来源于产甲烷古生菌。产甲烷古生菌 中包含三种密切相关的AksA同系物：2_异丙基苹果酸合酶（LeuA)和能够缩合乙酰辅酶A 和丙酮酸盐的柠苹酸盐（2-甲基苹果酸盐）合酶（CimA)。上述酶被确认参与了在产甲烷 菌及可能的缺乏苏氨酸脱水酶的其他菌种中的异亮氨酸的生物合成过程。在一些实施例 中，酰基转移酶为isopromylate合酶（如LeuA，EC 2. 3. 3. 13)或柠苹酸合酶（如CimA，EC 2.3. 1. 182)。然后，细胞中间体，高柠檬酸盐可经由多种途径转化为己二酸盐或己二酸，参 见图1。
[0035] 如图1所示，高柠檬酸盐可利用不同类型的脱羧酶通过生物转化为3-羟基己二酸 盐（步骤B)或3-酮己二酸盐（步骤C)。脱羧酶可从目标底物中移除二氧化碳。事实上， 高柠檬酸盐脱羧基经历了一系列的反应。高柠檬酸盐首先经脱水获得顺式-高乌头酸。顺 式-高乌头酸再水化制得苏-异-高柠檬酸。经过此水化/脱水反应之后C3羟基转移到 了 C2位。最终，苏-异-高柠檬酸脱羧基制得终产物2-酮基己二酸盐。
[0036] 然而，如图1所示，步骤B，高柠檬酸可在脱羧酶作用下转化为3-羟基己二酸 盐，该脱羧酶具有从-羟基羧酸盐中消除CO 2的活性，因此可用于催化高柠檬酸盐转化 为3-羟基己二酸盐的反应。例如，-乙酰乳酸脱羧酶（EC 4. I. 1. 5)可使乙酰乳酸脱羧 基制得乙偶姻（Goupil-Feuillerat, N ;Cocaign_Bousquet, M ;Godon, J-J ;Ehrlich, S. D ; Renault, P. J. Bacteriol. 1997, 179, 6285)。有报道称来源于产气杆菌的-乙酰乳酸脱羧 酶能够催化使用非天然的2-羟基-2-乙基-3-氧代丁酸盐作为底物的反应（Stormer，F. C. Methods Enzymol. 1975, 41B, 518)。有报道称 Arylmalonate 脱竣酶（EC4. I. 1. 76) 能够催化由-芳基丙二酸至-芳基羧酸的转化反应。Arylmalonate脱羧酶具有高活 性，因此该酶在生物催化过程中不需要辅助因子来提高其潜能（Miyam 〇t〇，K;Ohta，H. Eur. J. Biochem. 1992, 210, 475)。最近，结构引导的定向进化已被用于改造该酶的特 异性（Okrasa，K ;Levy，C ;Wilding，M ;Godall，M ;Baudendistel，N ;Hauer，B ;Leys，D ; Micklefield, J. Angew. Chem. Int. Ed. 2009, 48, 7691) 〇
[0037] 如图I所示，步骤C，高柠檬酸盐可通过氧化脱羧机制转化为3-酮己二酸盐。除 了释放二氧化碳，这种特殊类型的脱羧酶能够同时将-羟基氧化成氧代官能团。如在脂肪 酸降解途径中发现的该种酶。例如，来源于大脑微粒体的α-羟基酸脱羧酶被报道可催 化-羟基硬脂酸的脱羧反应（Levis, G. M ;Mead，J. F. J. Biol. Chem. 1964, 239, 77)。在另一 个实施例中，编码非血红素铁加氧酶的CloR被报道可在clorobiocin的单一生物合成途 径中催化两个连续的氧化脱羧反应（Pojer, F ;Kahlich, R ;Kammerer, B ;Li, S. M ;Heide, L. J. Biol. Chem. 2003, 278, 30661)。近期已利用功能模型对C