扩增的测序技术例如Sanger测序、焦磷酸测序、连接测序、大 量平行测序（又称为"下一代测序（NGS) "）和其他高通量测序方法可用于检测和定量样品 中革巴标核酸的存在。基于测序的技术可提供关于先如鉴别的基因的可变剪接和序列变异的 更多信息。测序技术包括多个步骤，大体上分为模板制备、测序、检测和数据分析。现有的模 板制备方法涉及将基因组DNA随机打断为较小的大小，每个片段固定于支撑物。空间上分 开的片段的固定化允许数以千亿计的测序反应同时进行。测序步骤可使用本领域众所周知 的多种方法中的任意一种。测序步骤的一个具体实例使用向互补链添加核苷酸以提供DNA 序列。检测步骤的范围从测量合成片段的生物发光信号到单分子四色成像。NGS技术产生 的大量数据需要在数据存储方面大量的信息学支持，以能从数以十亿计的测序读数进行基 因组比对和组装。此组装的验证也需要严苛的跟踪和质量控制。
[0124] 连接酶链式反应（LCR)可根据已知技术进行（Weiss，1991，Science 254 :1292)。 本领域技术人员可进行该实验方案的改变以满足所需需求。链取代扩增（SDA)也根据已知 技术或其满足特定需求的改变进行（Walker等人，1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 :392 396 和同上，1992, Nucleic Acids Res. 20 :1691 1696)。
[0125] 靶标捕获。在一个实施方案中，靶标捕获包括于在体外扩增前提高靶标核酸的浓 度或纯度的方法中。优选地，靶标捕获涉及相对简单的杂交和分离靶标核酸的方法，如在其 他文献中详细说明的（例如参见美国专利号6, 110, 678、6, 280, 952和6, 534, 273)。一般而 言，靶标捕获可分为两类，序列特异性的和非序列特异性的。在非序列特异性方法中，使用 试剂（例如二氧化硅微珠）捕获非特异性核酸。在序列特异性方法中，附着于固体支撑物 的寡核苷酸在适当杂交条件下与含有靶标核酸的混合物接触，以允许靶标核酸附着于该固 体支撑物，以允许从其他样品组分纯化该靶标。靶标捕获可由靶标核酸与附着于固体支撑 物的寡核苷酸之间的直接杂交产生，但优选地由与形成连接靶标核酸和固体支撑物上的寡 核苷酸的杂交复合物的寡核苷酸的间接杂交产生。该固体支撑物优选地是可从溶液分离的 颗粒，更优选地是可通过向容器施加磁场回收的顺磁性颗粒。在分离后，与该固体支撑物连 接的靶标核酸被洗涤并扩增，其中该靶标序列与适当的引物、底物和酶在体外扩增反应中 接触。
[0126] 通常，如果捕获方法实际上是特异性的，捕获寡聚体序列包括特异性结合靶标序 列的序列，以及将该复合物与固定化的序列通过杂交连接的"尾"序列。即，捕获序列包括 特异性结合本发明的标志物、PSA或另一前列腺特异性标志物（例如hK2/KLK2、PMSA、转谷 氨酰胺酶4、酸性磷酸酶、PCGEM1)靶标序列的序列和共价连接的3'尾序列（例如与固定化 的同聚物序列互补的同聚物）。尾序列例如5至50核苷酸长，与固定化的序列杂交以连接 含靶标的复合物与固体支撑物，从而从其他样品组分纯化杂交的靶标。捕获寡聚体可使用 任何骨架连接，但一些实施方案包括一个或多个2' -甲氧基连接。当然，本领域熟知其他捕 获方法。对帽结构的捕获方法（Edery等人，1988, gene 74(2) :517-525, US 5, 219, 989)和 基于二氧化硅的方法是捕获方法的两个非限制性实例。
[0127] 如本文所用，术语"纯化的"指与其原本存在的组合物的组分分离的分子（例如核 酸）。因此，例如"纯化的核酸"被纯化到天然不存在的水平。"基本纯"的分子是没有大部 分其他组分的分子（例如 30%、40%、50%、60%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、 97%、98%、99%、100%不含污染物）。相反，术语"粗的"表示未与其原本存在的组合物的 组分分离的分子。为简便，单位（例如66、67…81、82、83、84、85...91、92义..）没有具体提 及但仍然认为在本发明的范围内。
[0128] 如本领域所熟知，本文中的术语"Gleason评分"是最常用的腺癌评分/分期和预 后系统。该系统描述了 2和10之间的评分，其中2是最无侵袭性的，10是最有侵袭性的。 评分是发现的两个肿瘤生长的最常见模式（等级1-5)的和。模式（等级）需要占超过5 % 的活检样品才被计数。为准确，评分系统需要活检材料（核心活检或可操作样品）；不能使 用细胞制备物。如果活检确认了癌症的存在，那么确定癌症的范围和侵袭性（称为Gleason 等级）。病理学家通常鉴别两个前列腺癌的结构模式，并对每个模式给予Gleason等级：第 一等级与细胞外观相关，在1至5之间，第二等级与细胞排列相关，也在1至5之间。第一 等级由活检样品中的癌性细胞的外观决定；如果组织外观与正常前列腺组织相似，则给予 1的等级。如果组织没有正常特征，并且可在整个样品中看到癌细胞，则给予5的等级。对 外观介于1和5之间的组织给予2至4的等级。第二等级数与细胞的排列相关，也类似地 给予。
[0129] 然后将第一和第二等级数组合在一起以形成Gleason评分。Gleason评分越高， 肿瘤表现得越有侵袭性（快速生长）。如果癌组织显示第一等级3和第二等级4的肿瘤介 入，组合的Gleason评分是"3加4"或7。目前，约90%的新诊断为前列腺癌的男性具有6 或7的Gleason评分。小于6的Gleason评分通常称为低等级或良好分化的。6和7之间 的Gleason评分称为中等等级。8和10之间的Gleason评分的肿瘤是高等级或差分化的。
[0130] Gleason博士在开发此系统时发现，通过给出他能在任何具体患者的样品中看到 的两个最常见的模式的等级的组合，他能更好地预测具体患者表现好或坏的可能性。因此， 尽管看起来令人困惑，医生通常向患者给出的Gleason评分实际上是两个数字的组合或加 和，它足够准确以供广泛使用。这些组合的Gleason加和或评分可确定如下：
[0131] ?最低的可能的Gleason评分是2 (1+1)，其中第一和第二模式都具有1的Gleason 等级，因此加和时其总和为2。
[0132] ?非常典型的Gleason评分可能是5 (2+3)，其中第一模式具有2的Gleason等级 并且第二模式具有3的等级，或者一种纯粹模式6 (3+3)。
[0133] ?另一种典型的Gleason评分是7 (4+3)，其中第一模式具有4的Gleason等级并 且第二模式具有3的等级。
[0134] ?最后，最高的可能的Gleason评分是10(5+5)，其中第一和第二模式都有最不正 常的5的Gleason等级。
[0135] 另一个对前列腺癌分期的方法是使用如美国癌症联合委员会（AJCC)在AJCC Seventh Edition Cancer Staging Manual 中说明的"TNM 系统"。它说明了原发肿瘤（T 期）、不存在或存在扩散至邻近淋巴结（N期）和不存在或存在远距离扩散，或转移（M期） 的范围。每个?!分类的种类分为代表其特定状态的亚类。例如，原发肿瘤（T期）可分 为：
[0136] · Tl :肿瘤不能被直肠指检感觉到或被成像研宄看到，但活检样品中存在癌细胞；
[0137] · T2 :肿瘤可在DRE期间感觉到，并且癌局限于前列腺内；
[0138] · T3 :肿瘤扩展到前列腺囊（围绕前列腺的纤维组织层）和/或贮精囊（前列腺 旁两个储存精液的小囊），但没有其他器官受影响；
[0139] · T4 :肿瘤扩散或附着到前列腺旁的组织（贮精囊以外的）。
[0140] 淋巴结涉及被分为以下两类：
[0141] · NO :癌未扩散到任何淋巴结；
[0142] · Nl :癌扩散到局部淋巴结（骨盆内）。
[0143] 转移一般分为以下两类：
[0144] · MO :癌未转移（扩散）超出局部淋巴结；和
[0145] · Ml :癌转移到远处淋巴结（骨盆外）、骨或其他远处的器官例如肺、肝或脑。
[0146] 此外，T期进一步分为亚类Tla-c、T2a-c、T3a_b和T4。本领域熟知上述各个亚类 的特征，可在多个教科书中找到。
[0147] 对照样品。术语"对照样品"、"正常样品"或"参比样品"在本文中指可指示或代 表非癌性状态（例如非前列腺癌状态）的样品。对照样品可从未罹患前列腺癌的患者/个 体获得。也可使用其他类型的对照样品。在确定阈值后，也可设计提供预定的阈值的信号 特征的对照样品并用于本发明的方法。诊断/预后测试特征通常为以下4个性能指标：灵 敏性（Se)、特异性（Sp)、阳性预测值（PPV)和阴性预测值（NPV)。以下表格给出了用于计算 上述4个性能指标的数据。
[0148]
【主权项】
1. 一种提供受试者中前列腺癌临床评估的方法，所述方法包括： (a) 确定来自所述受试者的生物样品中至少两个表5或6A中列出的前列腺癌标志物或 与其在前列腺癌中共调控的标志物的表达； (b) 用一个或多个对照标志物标准化所述至少两个前列腺癌标志物的表达； (c) 对所述至少两个前列腺癌标志物的经标准化的表达水平进行数学关联； (d) 从所述数学关联获得评分；和 (e) 根据所述获得的评分提供所述前列腺癌的临床评估。
2. -种提供受试者中前列腺癌临床评估的方法，所述方法包括： (a) 选择根据其在已知患有或不患前列腺癌的患者群体的尿中表达谱验证的至少两个 前列腺癌标志物； (b) 确定所述至少两个前列腺癌标志物在来自所述受试者的生物样品中的表达； (c) 用一个或多个对照标志物标准化所述至少两个前列腺癌标志物的表达； (d) 对所述至少两个前列腺癌标志物的经标准化的表达进行数学关联； (e) 从所述数学关联获得评分；和 (f) 根据所述获得的评分提供所述前列腺癌的临床评估。
3. 如权利要求1或2所述的方法，其中所述至少两个前列腺癌标志物是至少三个前列 腺癌标志物；至少四个前列腺癌标志物；至少五个前列腺癌标志物；至少六个前列腺癌标 志物；至少七个前列腺癌标志物；至少八个前列腺癌标志物或至少九个前列腺癌标志物。
4. 如权利要求1至3任一项所述的方法，其中所述至少两个前列腺癌标志物选自： (1)CACNAlD或与其在前列腺癌中共调控的标志物； (2) ERG或与其在前列腺癌中共调控的标志物； (3) H0XC4或与其在前列腺癌中共调控的标志物； (4)ERG-SNAI2前列腺癌标志物对； (5)ERG-RPL22L1前列腺癌标志物对； (6) KRT15或与其在前列腺癌中共调控的标志物； (7) LAMB3或与其在前列腺癌中共调控的标志物； (8) H0XC6或与其在前列腺癌中共调控的标志物； (9) TAGLN或与其在前列腺癌中共调控的标志物； (10) TDRD1或与其在前列腺癌中共调控的标志物； (11) SDK1或与其在前列腺癌中共调控的标志物； (12) EFNA5或与其在前列腺癌中共调控的标志物； (13) SRD5A2或与其在前列腺癌中共调控的标志物； (14)maxERGCACNA1D前列腺癌标志物对； (15) TRIM29或与其在前列腺癌中共调控的标志物； (16) OR51E1或与其在前列腺癌中共调控的标志物；和 (17) HOXC6或与其在前列腺癌中共调控的标志物。
5. 如权利要求1至4任一项所述的方法，其中所述至少两个前列腺癌标志物包括 CACNA1D或与其在前列腺癌中共调控的前列腺癌标志物。
6. 如权利要求1至4任一项所述的方法，其中所述至少两个前列腺癌标志物包括 CACNA1D或与其在前列腺癌中共调控的前列腺癌标志物，以及ERG或与其在前列腺癌中共 调控的前列腺癌标志物。
7. 如权利要求4所述的方法，其中所述前列腺癌标志物按如表7-9所定义的分类器组 合。
8. 如权利要求1至7任一项所述的方法，其中所述与其在前列腺癌中共调控的标志物 中的一个或多个如表6B所定义。
9. 如权利要求1至8任一项所述的方法，其中所述一个或多个对照标志物包括内源参 比基因。
10. 如权利要求1至8任一项所述的方法，其中所述一个或多个对照标志物包括至少一 个前列腺特异性对照标志物。
11. 如权利要求1至8任一项所述的方法，其中所述一个或多个对照标志物如表2、表 7A和/或表7B所定义。
12. 如权利要求10所述的方法，其中所述前列腺特异性对照标志物包括KLK3、FOLH1、 F0LH1B、PCGEM1、PMEPA1、OR51El、OR51E2 和PSCA中的一个或多个。
13. 如权利要求10所述的方法，其中所述对照标志物包括KLK3、IP08和POLR2A。
14. 如权利要求10所述的方法，其中所述一个或多个对照标志物包括IP08、POLR2A、 ⑶SB、TBP和KLK3。
15. 如权利要求1至14任一项所述的方法，其中所述前列腺癌的临床评估包括： (i) 前列腺癌的诊断； (ii) 前列腺癌的预后； (iii) 前列腺癌的分期评估； (iv) 前列腺癌侵袭性分类； (v) 治疗有效性评估； (vi) 前列腺活检需求的评估；或 (vii) (i)至（vi)的任意组合。
16. 如权利要求1至15任一项所述的方法，其中所述标志物是基因。
17. 如权利要求1至15任一项所述的方法，其中所述标志