膜分选培养器、膜分选培养试剂盒、和使用其的干细胞分选方法、以及分离膜的制作方法
【专利说明】膜分选培养器、膜分选培养试剂盒、和使用其的干细胞分选 方法、W及分离膜
[0001] 本申请是2012年3月30日提交的题为"膜分选培养器、膜分选培养试剂盒、和使 用其的干细胞分选方法、W及分离膜"的PCT/JP2012/058637号发明专利申请的分案申请， 原申请进入中国国家阶段获得的国家申请号为201280016688. 1。
技术领域
[0002] 本发明涉及用于分选任意生物种类的干细胞和牙髓干细胞的膜分选培养器、膜分 选培养试剂盒、和使用其的干细胞分选方法。本发明特别涉及用于分选为了牙髓再生而填 充于根管中的牙髓干细胞或间充质干细胞的膜分选培养器、膜分选培养试剂盒和使用其的 干细胞分选方法。本发明还涉及分离膜、表面改性方法和利用其的分离膜的制造，提供不损 害分离性能而将由疏水性聚合物构成的膜亲水化W抑制将细胞透过分离时对膜的粘附的 分离膜。因此，本发明适用于W血液净化领域、再生医疗为中也的细胞分离纯化领域中。另 夕F，聚合物表面改性方法可W简便地进行仅聚合物表面的改性，由于同时还可进行灭菌处 理，因而与W往方法相比可有助于生产效率化。
【背景技术】
[0003] 现在，拔髓治疗或感染根管治疗的生物学根管填充材料中所用的牙髓干细胞是 血管新生能力、神经再生能力和牙髓再生能力优异的级分。主要使用的是来源于牙髓的 CD3rSP (边缘群)细胞、CD105+细胞或CXCR4+细胞等。SP细胞是用化echst33342标记，并 通过流式细胞仪用化echst Blue和化echst Red来对强烈排出该色素的级分进行分选， 大量含有干细胞。然而，由于化echs口3342是DNA结合色素，而且必须使用流式细胞仪，因 而人们认为在细胞的安全性方面存在问题。
[0004] 另一方面，开发有在使用针对干细胞特异性膜表面抗原的抗体时，不使用流式细 胞仪而使用磁珠的方法。例如，作为骨髓干细胞，已知CD34或CD133抗体珠，但需要一定程 度的组织细胞量。所W，不适于从牙髓组织进行分选的情形。另外，人牙髓的情形中，CD34 阳性细胞和CD133阳性细胞分别为牙髓样本细胞的0. 01%和0. 5%，基本不存在，因而现存 (市售)的磁珠法不适合。对CD105或CXCR4的抗体珠来说，由于是定制品，因而有可能非常 昂贵。另外，作为从脂肪组织分离干细胞的仪器，在临床上已经使用了 W利用酶消化法和离 也分离法的细胞分离为基本的Celution 800/CRS系统，但需要大量组织，所得细胞为异源 群体且多含前体细胞，而且昂贵。进而，作为从骨髓组织分离干细胞的仪器，商品化有Bone Marrow MSC S巧aration Device。据说其通过用由人造丝和聚己帰形成的纤维来捕获骨髓 间充质细胞，从而可在短时间（20分)内采集干细胞，比较廉价，但却需要比较大量的骨髓组 织(髓液)，所得细胞仍然为异源群体且多含前体细胞。因此，不使用酶消化法而从固体的组 织分选干细胞并使之增殖的装置尚未发明。
[0005] 另外作为膜分选器，可W将作为上部结构的插入式细胞培养皿（Cellcul化re Inse;rt)(聚碳酸醋膜（Polycarbonate Membrane)Transwell(注册商标）Inserts、2Xl〇5孔 /cm2、孔尺寸8 y m、底面的直径6. 4 mm、开口部的直径11. 0 mm、高度17. 5 mm) (Corning) 插入作为下部结构的24孔板（直径15. 0 mm、开口部的直径15. 0 mm、高度22. 0 mm) (Falcon)来使用。然而，对于PET膜或聚碳酸醋膜来说，细胞的附着多，无法有效地进行向 下层的迁移。进而，由于是开放形状，因而微生物所致的污染的危险大，无法保证细胞的安 全性。
[0006] 因此，需要开发廉价且有效地从人牙髓组织或人牙髓细胞分选干细胞的方法。
[0007] 迄今为止，已知可W将骨髓中存在的CXCR4+细胞、C-MET+细胞或LIF-R+细胞分 别利用其配体SDF1、HGF或LIF的浓度梯度，通过迁移趋化效果而浓缩为骨髓的干细胞(非 专利文献1)。
[0008] 另外，已知可W将骨髓、末梢血和厮带血的干细胞（CXCR4+ /lin7CD133+ /CD45+ 细胞的造血干细胞和CXCR4+ ^in7CD133+ /CD45-细胞的间充质干细胞)通过SDF1的浓度 梯度同样地浓缩(非专利文献2)。此时，在现成的Costar化answell 24-孔的Sum孔径 (孔尺寸）的滤器下部的腔室中装入SDF-1，在上部装入欲要浓缩的细胞。然而，考虑安全性 时，由于SDF-1还未受到药事认可，因而期望使用替代SDF-1的安全且有效的迁移因子。
[0009] 另外，作为对骨髓干细胞的迁移有效的因子，已知来源于血小板的銷胺醇-1-磯 酸（S1P)(非专利文献3)，作为对脂肪干细胞的迁移有效的因子，已知原儿茶酸（非专利文 献4)。但是，仍然尚未解决安全性的问题。进而，还已知血管新生?神经再生和牙髓再生 能力优异的牙髓CD31-SP细胞相对于SDF-1或VEGF迁移（非专利文献5)。但是，目前对 SDF-1 W外的血管新生?神经再生和牙髓再生能力优异的牙髓干细胞的分选有效的迁移因 子并不明确。
[0010] 能够安全且实用地分选牙髓干细胞的膜分选培养器和迁移因子受到需求。另外， 在人干细胞之外，各种生物种类中由干细胞分化诱导各组织的机理的阐明在生物学研究中 受到追求。伴随再生医疗的进展，能够简便且稳定地分选干细胞的膜分选培养器和迁移因 子受到期待。
[0011] 对于与体液、血液或细胞接触的医疗用的分离膜，若蛋白质或血小板、细胞等附着 则分离膜的性能降低、或成为引起机体反应的原因，细胞自身的吸附也受到促进等，要解决 的问题多。另外，净水器等的水处理膜中，蛋白质或有机物的附着会引起分离膜的性能降 低。对于上述问题，尝试了通过将分离膜亲水化来解决，进行各种研究。例如，公开了使作 为亲水性高分子的聚己帰基化咯焼丽与由聚讽形成的膜在制膜原液的阶段混合并进行成 形，由此对膜赋予亲水性W抑制污垢的方法(专利文献1)。然而，该些方法中，对表面赋予亲 水性时受到下述制约；需要增多制膜原液中的亲水性高分子的量、或者限于与作为基材的 高分子具有相容性的亲水性高分子、或者对应于材料的使用用途必需研究最适的原液组成 等。
[0012] 另外，专利文献2中公开了将聚己帰醇缩酵二己基氨基己酸醋和亲水化试剂涂布 于膜来实现亲水化的方法。该方法中，有可能聚己帰醇缩酵二己基氨基己酸醋被覆亲水化 试剂、非附着相关的效果骤减。另外，由于使膜浸溃于聚己帰醇缩酵二己基氨基己酸醋和亲 水化试剂的各溶液中，因而膜的分离性能也有可能降低。
[0013] 公开了通过高能射线使要进行水不溶化的聚己帰基化咯焼丽等亲水性成分水不 溶化并导入所形成的膜中的方法(专利文献3)、或使聚讽系的分离膜与聚己帰基化咯焼丽 等亲水性高分子溶液接触后、通过放射线交联而形成不溶化的被膜层的方法(专利文献4)。 然而，聚己帰基化咯焼丽等水性高分子和聚讽系高分子由于分子间的相互作用弱，因而存 在难W形成被膜层的问题。
[0014] 因此，公开了使一定范围的皂化度的聚己帰醇水溶液与聚讽系分离膜接触，通过 聚讽和己酸己帰醋的疏水性相互作用而有效地形成膜表面的被膜层的方法(专利文献5)。 然而，该文献并非关于附着抑制的方法，因而本发明人的研究结果得知，若将聚己帰醇单纯 地被覆于分离膜，则分离膜的性能降低显著。另外，已知聚己帰醇的羟基在与血液接触时容 易将补体活化。
[0015] 进而，据说即使用聚己帰基化咯焼丽、聚己二醇之类的亲水性高分子被覆材料表 面，附着抑制效果也仅能暂时性地抑制(非专利文献6)。目P，尚未确立用高性能的分离膜来 满足血液适合性的分离膜组件。
[0016] 现有技术文献 专利文献 专利文献1 ;日本特公平2-18695号公报 专利文献2 ;日本特开平8-131791号公报 专利文献3 ;日本特公平8-9668号公报 专利文献4 ;日本特开平6-238139号公报 专利文献5 ;日本特开2006-198611号公报 非专利文献 非专利文献 1 :Kucia M. , et al. , Arch. Immunol. Ther. Exp. 2006 非专利文献 2 :Baumert B. et al. , Folia Histochemica Et Cytobiologica 2008 非专利文献 3 ;Meriane M.，et al.，Stem Cells 2006 非专利文献 4 ;Wang H. , et al. , Elur. J.化armacol. 2008 非专利文献 5;Iohara K.et al., STEM CEIXS Volume 26, Issue 9, pages 2408-2418， September 2008 非专利文献6:医疗ナ/テク/口ッ一杏林图書PP115-116。
【发明内容】
[0017] 发明要解决的技术问题 W往的流式细胞仪或磁抗体珠法无法成为满足临床使用基准(药品和准药品的制造管 理和品质管理的基准相关的部令（医薬品及医薬部外品0製造管理及品質管理0基 準^関十^省令）（GMP))的安全且高效、廉价的分选方法。本发明是鉴于上述问题而完成 的发明，其目的在于针对牙髓再生治疗和其它再生治疗提供不使用流式细胞仪或磁抗体珠 而由少量的组织也可W安全、高效且廉价地得到所期望的干细胞的培养器、用于其的迁移 因子W及干细胞分选方法。进而，其目的在于提供能够适用于所有生物种类的干细胞(胚胎 干细胞、iPS细胞和组织干细胞）的分选的膜分选培养器、膜分选培养试剂盒和干细胞分选 方法。
[001引本发明的进一步的目的在于提供改良了分离膜相关的现有技术的缺点，具有能够 在通常的细胞培养用赔育器、洁净台中使用的紧凑性，改良了基于孔径的过滤性能W及表 面亲和性的高性能的分离膜。
[0019] 用于解决技术问题的方法 本发明人为了达成上述课题而进行了深入研究，结果发现，利用细胞迁移因子的浓度 梯度，可W使干细胞从膜上部至膜下部选择性地通过，可W分选干细胞，从而完成了本发 明。所W，根据一个方式，本发明是膜分选培养器，其含有上部结构体和下部结构体，所述上 部结构体由容器构成，该容器的底面的至少一部分用具有干细胞透过用孔的分离膜形成， 所述下部结构体由容器构成，该容器保持使所述上部结构体的膜浸溃于其中的流体。
[0020] 优选的是所述分离膜具备基材膜和功能层，所述基材膜由疏水性聚合物构成，所 述功能层是选自己帰基化咯焼丽系聚合物、聚己二醇系聚合物和己帰醇系聚合物中的1种 W上的亲水性聚合物通过共价键键合于所述基材膜的表面而成的功能层，构成所述功能层 的亲水性聚合物的重量为所述分离膜总重量的1. 5重量％至35重量％。
[002U 优选的是所述孔的尺寸为3ym~10ym，密度为lX105~4X10 6孔/cm2。
[0022] 优选的是具备多个所述上部结构体，并进一步含有框体，所述框体容纳于所述下 部结构体中、且具备设置有将该多个上部结构体的各个固定的多个孔的板状构件。
[0023] 或者优选的是具备多个所述上部结构体，并进一步含有框体，所述框体容纳于所 述下部结构体中、且具备设置有将该多个上部结构体的各个固定的多个孔的板状构件，所 述下部结构体由于所述该多个上部结构体的各个对应的多个容器构成。
[0024] 或者还优选所述多个上部结构体具有不同孔尺寸和/或不同孔密度的膜。
[00巧]优选进一步含有盖状结构体，所述盖状结构体可覆设或密封上述上部结构体和下 部结构体。
[0026] 优选所述盖状结构体进一步含有具备气体导入口和气体排出口的气体交换装置。
[0027] 优选所述盖状结构体的至少一部分是由具有孔尺寸1~lOOnm的孔的膜形成的。
[0028] 优选在所述盖状结构体和所述下部结构体之间设置有密封用的弹性体。
[0029] 优选进一步具备温度调节系统，该温度调节系统含有温度测定装置和温度调节装 置。
[0030] 优选所述下部结构体进一步含有具备培养基导入口和培养基送出口的培养基交 换系统。
[0031] 根据另一方面，本发明是膜分选培养试剂盒，其含有前述任一项中所述的膜分选 培养器、和用于注入所述下部结构体的细胞迁移因子。
[0032] 优选所述细胞迁移因子是选自SDF-l、G-CSF、bFGF、TGF-目、NGF、PDGF、抓NF、GDNF、 EGF、VEGF、SCF、MMP3、Slit、GM-CSF、LIF、HGF、S1P、原儿茶酸、和血清中的一种 W上。
[0033] 优选所述细胞迁移因子的浓度为Ing/ml~50化g/ml。
[0034] 优选进一步含有用于注入所述下部结构体的血清，所述细胞迁移因子为G-CSF或 bFGF。
[0035] 根据又一方面，本发明是使用上述任一膜分选培养器的干细胞分选方法，其包括： 将样本细胞或样本组织接种于所述上部结构体的膜的步骤、将含有细胞迁移因子的培养基 填充于所述下部结构体的容器的步骤、和使所述上部结构体的膜与所述下部结构体中的培 养基接触的步骤。
[0036] 优选所述细胞迁移因子是选自SDF-l、G-CSF、bFGF、TGF-目、NGF、PDGF、抓NF、GDNF、 EGF、VEGF、SCF、MMP3、Slit、GM-CSF、LIF、HGF、SIP、原儿茶酸、和血清中的一种 W上。
[0037] 优选所述细胞迁移因子的浓度为Ing/ml~50化g/ml。