一种核酸快速提取装置及方法_2

文档序号:8375815阅读:来源:国知局
中,第一腔体21的底部内侧设置有微孔过滤膜26,该微孔过滤膜位 于水平分隔体24上方,水平分隔体24设置有连通第二腔体的出液孔25,从而实现离心过程 液体的连通,并最终将液体离心至离心柱下方套接收的离心管10中。当然在本发明的其他 实施例中,将微孔过滤膜设置于水平分隔体24与离心柱底部24之间,并保证核酸吸附膜位 于微孔过滤膜的下方,也能够解决本发明的技术问题,达到相应技术效果。
[0023] 在本发明优选实施例中,离心柱20顶部设置有分别与第一腔体21和第二腔体22 连接的开口 30,离心柱底部的内侧设置有核酸吸附膜29。其中,离心柱20底部设置有具有 通孔28的装载封盖27,该核酸吸附膜27离心时承托于装载封盖27并卡嵌在离心柱20的 下端部内侧,同时,为了在核酸提取步骤中的吸附步骤中有效地吸附在第一腔体21中经过 裂解、结合、漂洗而获得的样品中的核酸,核酸吸附膜位于第二腔体22内并介于水平分隔 体下方与离心柱底部的内侧,从而高效率的获取得到样品中的核酸。需要说明的是,当本发 明的核酸快速提取装置用于痕量(如法医鉴定)样品的核酸提取时,直接将收集痕量样品的 拭子、棉签、精斑、血斑、烟蒂等检材直接放置于第一腔体21,经过经典的核酸提取步骤中所 采用的裂解、结合、漂洗步骤,使样品中的核酸充分收集从而达到高效率提取的目的,有效 避免因拭子、棉签、精斑、血斑、烟蒂等检材的吸附和离心管壁的吸附而造成微量核酸物证 的损失,提尚核酸提取效率。
[0024] 另外,关于离心管的使用,本发明主要是通过离心柱的改进从而达到提高核酸提 取效率以及避免交叉污染的技术效果,在本发明的其他实施例中,如果仅仅处于上述技术 目的,本发明的方案中可以不包含离心管的设置。另外对于离心管的选择也可以参照现有 技术选择与本发明技术方案中匹配的各种类型的离心管作为液体收集装置。当然需要说明 的是,由于在核酸提取的结合、漂洗、洗脱步骤中均包含离心步骤,在结合、漂洗步骤中离心 管可以视情况而定考虑是否更换,而最后的洗脱步骤中,核酸最终通过该步骤收集与离心 管中,因此,洗脱步骤中需要更换原先步骤中所用离心管。
[0025] 从提取效果上来看,核酸吸附膜及微孔过滤膜的选择均非常重要,直接关系到核 酸提取的效率以及最终提取的核酸的质量,因此,在本发明优选实施例中微孔过滤膜为聚 醚砜膜,而核酸吸附膜为玻璃纤维膜。其中,聚醚砜膜具有物理、化学性能稳定,有很好的相 容性,且其孔径,孔隙率高、纳污量大、可反冲和高温消毒的特点,有效地滤除样品中核酸外 杂质。而或者玻璃纤维膜具有良好的核酸吸附性能,将样品中的核酸成分充分有效地吸附, 保证核酸提取效率。另外,在本发明的其他实施例中,也可以根据具体的需要,在保证核酸 提取效率及质量的前提下,选择其他成分的微孔过滤膜或者核酸吸附膜也是完全可行的, 例如,选择采用硅胶膜作为核酸吸附膜也是完全可行的。
[0026] 具体实现时,本发明实施例中采用的离心柱的水平横截面为圆形,竖直分隔体分 割离心柱水平横截面圆形直径的3/4至4/5。同时为了保证有效分隔及核酸吸附膜的充分 吸附,水平分隔体距离心柱底部内侧的核酸吸附膜2-5mm。
[0027] 当然,作为优化方案,核酸快速提取装置还包括盖合离心柱顶部设置的开口 30的 管盖31。在本发明优选实施例中,管盖衔接设置于离心柱的顶部边缘在加入样品或者相应 缓冲液后都需要进行闭管操作,以避免交叉污染。当然,在本发明的其他实施例中,也可以 将管盖衔接设置于离心管的顶部边缘,在离心柱放入离心管时,也能够通过衔接设置于离 心管的顶部边缘的管盖合离心柱顶部的开口 30。
[0028] 另一方面,本发明实施例还提供了一种基于上述核酸快速提取装置实现的核酸快 速提取方法,依次包括如下步骤: (1)裂解:将待测样品或者附着有待测样品的检测材料放入离心柱第一腔体中,加入 150-300ul裂解液,于 56-65°C加热裂解 10_30min; (2) 结合:静置冷却至室温,向离心柱第一腔体中加入结合液150-300ul,混匀, 6000-20000g离心l_2min; (3) 漂洗:向离心柱第一腔体加入300-500ul漂洗液A,6000-20000g离心l-2min;然 后再向离心柱第一腔体加入300-500ul漂洗液B,6000-20000g离心l-2min;空管20000g 离心 2_5min; (4) 洗脱:向离心柱第二腔体中加入20-lOOul洗脱液至核酸吸附膜上,室温静置 5-lOmin,20000g离心 2min。
[0029] 其中,所述裂解液中含有如下含量的成分:胍盐0. 1-1M,胍盐浓度优选0. 2M,胍盐 优选盐酸胍、异硫氰酸酸胍的一种或其组合;十二烷基磺酸钠或十二烷基硫酸钠0.1- 4%, 优选l%;TrisImM- 20mM,优选 10mM;CaC12l-10mM,优选 2mM;TritonX-100 0.1-3%,优 选1. 5% ;裂解液pH值7. 2-8. 0,优选7. 5。优选地,在裂解步骤中还可以与裂解液一同添加 蛋白酶K2-20U每次(每人份),优选12U每次(每人份)。
[0030] 所述结合液中含有如下含量的成分:胍盐1-6M,胍盐浓度优选4M,胍盐优选盐酸 胍、异硫氰酸酸胍的一种或其组合;聚合度为6000-20000的聚乙二醇10-40%,聚乙二醇聚 合度优选8000,聚乙二醇浓度优选30%;无水乙醇30-80% (v/v),优选50%;TrisImM- 20 mM,优选10mM;结合液pH值6-7.5,优选7.0。
[0031] 所述漂洗液A中含有如下含量的成分:胍盐0. 1-2M,胍盐浓度优选1M,胍盐优选盐 酸胍、异硫氰酸酸胍的一种或其组合;EDTAl-10mM,优选2mM;无水乙醇30-80%(v/v),优选 50%;1'1^11111-2〇1111,优选1〇1111;漂洗液六的口11值为6-7.5,优选7.0。
[0032] 所述漂洗液B:NaC10. 1-2M,优选0.5M;TrisImM- 20禮,优选10mM;无水乙醇 30-80% (v/v),优选50% ;漂洗液B的pH值为6-7. 5,优选7. 0。
[0033] 所述洗脱液为去离子水或pH8. 0的10mMTris-HCl。
[0034] 结合上述实现方式,本发明还提供了如下实施例对本发明的核酸快速提取方法进 行进一步详细说明: 实施例1 本发明的核酸快速提取装置拭子检材中的全血DNA,包括以下步骤: (1)准备模拟拭子检材 将无菌Omni拭子放入本发明离心柱第一腔体21中,按压杆的末端,弹出拭子,向拭子 上加入50ul新鲜EDTA抗凝小鼠全血,作为模拟拭子检材。
[0035] (2)裂解 向拭子上加入200ul裂解液(Lysisbuffer)和20ul蛋白酶K,盖上管盖,65°C裂解 20min〇
[0036] (3)结合 向拭子上加入200ul结合液(bindingbuffer),混勾后,20000g离心2min。
[0037] (4)漂洗 向离心柱第一腔体中加入500ul漂洗液A(washbufferA),盖好管盖,12000g离心lmin,将离心柱转移到新的收集管中,加入500ul漂洗液B(washbufferB),盖好管盖,再 次12000g离心lmin,将离心柱转移到新的收集管中,20000g离心2min。
[0038] (5)离心柱转移至新的离心管中,从离心柱的第二腔体22中往核酸吸附膜上加入 50ul洗脱液(Elutionbuffer),室温放置5min,20000g离心lmin,丢弃离心柱,离心管中 的DNA溶液用于检测或-20°C储存。
[0039] 实施例2 常规离心柱法提取拭子检材中的全血DNA,包括以下步骤: (1)准备模拟拭子检材 将无菌Omni拭子放入1. 5ml离心管中,按压杆的末端,弹出拭子,向拭子上加入50ul新鲜EDTA抗凝小鼠全血,作为模拟拭子检材。
[0040] (2)裂解 向拭子上加入200ulLysisbuffer和20ul蛋白酶K,盖上管盖,65°C裂解20min。
[0041] (3)结合 向拭子上加入200ulbindingbuffer,混勾后,12000g离心lmin,将上清液转移至常规 离心柱中,12000g离心lmin,将离心柱转移到新的收集管中。
[0042] (4)漂洗 向离心柱中加入500ulwashbufferA,盖好管盖,12000g离心lmin,将离心柱转移到 新的收集管中,加入500ulwashbufferB,盖好管盖,再次12000g离心lmin,将离心柱转 移到新的收集管中,20000g离心2min。
[0043] (5)离心柱转移至新的离心管中,向离心柱正中央加入50ulElutionbuffer,室 温放置5min,20000g离心lmin,丢弃离心柱,离心管中的DNA溶液用于检测或-20°C储存。
[0044] 实施例3 : 本发明的核酸快速提取装置提取血斑检材中的DNA,包括以下步骤: (1)准备模拟血斑检材 切下0. 5cm2牛仔织物,向牛仔织物上加入50ul新鲜EDTA抗凝小鼠全血,室温放置1 小时,使其自然干燥,作为模拟血斑检材。然后将模拟血斑检材剪成小块,放入本离心柱第 一腔体21中。
[0045] (2)裂解 向模拟血斑检材上加入200ulLysisbuffer和20ul蛋白酶K,盖上管盖,65°C裂解 20min〇
[0046] (3)结合 向模拟血斑上加入200ulbindingbuffer,混勾后,20000g离心2
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