料培养皿中，注入高糖DMEM培养基进行培养，使用I %的青霉素-链霉素，10%的牛血清在37°C、5%C02环境中进行培养。当细胞培养24h后，溶液采用新的培养基进行替换，并加入40ul金纳米棒溶液。再经过4h的培养后，将盖玻片从培养皿中取出并倒置于载玻片上进行观察。米用400ms的曝光时间米集图片。
[0037]5、金纳米棒和纳米球的表征
[0038]图1-4分别给出了金纳米棒和金纳米球的紫外可见光谱和透射电子显微镜图。金纳米棒通过三步生长法获得，最终的金纳米棒的长轴等离子体共振吸收峰调节至650nm，长径比在2.2左右，已有研宄表明这个长径比的金纳米棒相对于其他的长径比金纳米棒具有更高的散射效率。三步法不仅很容易重复制作所需形状和尺寸的金纳米棒，而且提高了金纳米棒的单分散性，得到金纳米棒的两个紫外可见的峰位置分别在650nm和532nm。透过通射电子显微镜统计得到的金纳米棒的长度和直径分别为75.2±6.5nm和37.1±4.3nm，证明了金纳米棒具有较少的尺寸分布。柠檬酸包裹的金纳米球通过常规技术合成。最终得到的金纳米球溶液为红色，在533nm具有较窄的吸收峰。透射电子显微镜进一步证实了金纳米球的直径在44.1 ±3.7nm。
[0039]6、偏光显微镜选择性地对玻片上的纳米粒子成像
[0040]偏光显微镜是一项非常特殊的技术，可以观察光学各向异性特征的样品。在这项技术中，起照明作用的偏振光被检偏器滤掉后形成了黑暗的背景，同时各向异性的样品显得比较明亮。众所周知，对单个纳米粒子进行成像对研宄纳米粒子的事件十分重要，可以提供物理学和生物学过程细节信息。直到现在，偏光显微镜还没有用于单个纳米粒子的监测，其困难在于纳米粒子一般在纳米尺度，不容易被偏光显微镜检测到。然而，由于金纳米棒优良的光学特性，我们通过仔细调节偏光显微镜的光学元件成功观测到了单个粒子。如图5B，单个金纳米检在偏光显微镜下呈现明亮的红色，这与其长轴等离子体共振吸收峰是一致的。图中多个亮黄色的点出现可能是由于金纳米棒的聚集造成的。作为对比，同一区域的金纳米棒也使用暗场显微镜进行了成像(图5A)。在暗场显微镜下会有更多的亮点出现。它们当中的大多数是绿色的，这可能是由于球状纳米粒子的散射造成的，这是因为通过种子生长法制备得到的金纳米棒总是会伴随着一些颗粒的产生。
[0041]为了证明这一点，我们进一步研宄了直径为44nm的金纳米球在偏光显微镜下和暗场显微镜下的散射，如图5C和D，结果显示:在暗场下呈现绿色的金纳米球在偏光显微镜下观察不到了，这是因为单个的金纳米球各向是均一性的，不会对光去极化。但是，如果金纳米球的二聚体、三聚体或者多聚体生成，这些团聚体具有这些功能。同时，它们当中极少数的点呈现红色。据报道单个金纳米棒可以看成一个方向偶极子，这些消失的红点是由于金纳米的方向很特殊，即金纳米棒的长轴与偏光器或者检偏器是一致的。因此，偏光显微镜在观察玻片上静止的金纳米棒时还有一定局限性的，但是对观察不同环境下动态的金纳米棒应该是很有用的。因此偏光显微镜对观察各向异性的金纳米棒仍然是一个很好的技术。
[0042]相比于暗场显微镜，偏光显微镜用于纳米颗粒成像时有很多新的突出特点。首先，我们可以非常直观地观察到，在偏光显微镜下金纳米棒的光点要比在暗场图像下小很多。事实上，在偏光显微镜下单个光点占到71±26相素，只在暗场显微下的光点的42%左右，如图5E和5F所示，主要原因是金棒的散射光和照射光束在偏光显微镜的检测器处会有一定的干涉，所以，偏光显微镜能够提供样品更高的空间分布图像；第二，单个金纳米棒的平均强度比暗视场显微镜下的强度要高，而且光的强度是变化的。强度的不同是不可无法避免的。当金纳米棒的与偏光器和检偏器的夹角为45度时检测到的光强是最大的。作为比较，当长轴方向垂直于检偏器时是检测不到光强的；最后，而且最重要的是偏光显微镜可以显著地降低背值。如图所示，暗场下模糊的白色斑点在偏光显微镜下被清除了。因为溶液或者玻片上的物质不能够去光去极化。所以，我们通过下面的方向来计算金信噪比，SNR=(Is-1b)人，其中Is为金纳米棒的光强，Ib背景光强，b为背景噪音。结果显示:偏光显微镜下相比于暗场显微镜，信噪比增大了 3.6倍。我们得出的结论是:当金纳米棒能够被偏光显微镜轻易的观测到时，这种技术在生物学领域将得到广泛的应用。
[0043]7、以金纳米棒为探针选择性检测癌细胞
[0044]以金纳米棒为探针，在其表面修饰具有选择性识别癌细胞的功能分子，实现了对癌细胞的检测。如图6所示，用EGFR抗体修饰的金纳米棒，可以选择性地对HeLa细胞进行高信噪比成像，而对于不表达EGFR的细胞，如HepG2细胞反而不能够被识别。
[0045]金纳米棒的很多特性都用来开发了各种成像技术，但其对光的去极化特性仍然没有的扫很好的应用，本研宄中，我们采用偏光显微镜观察单个金纳米棒，偏光显微镜用于成像会有很明显的优势，我们发现偏光显微镜能够对各向异性的纳米材料进行选择性成像，相比较而言，传统的暗场显微镜没有这种功能。在偏光显微镜下，金纳米棒的散射光点具有较小的尺寸，能够显著降低成像的背景值，相应地图像的信噪比得到至少3倍以上的改善。更重要的是，即使在细胞中单个金纳米棒也能够被偏光显微镜以极小的背景值观测到，由于这种独特的光学性能，各向异性纳米材料和偏光显微镜在癌细胞成像和检测中有着巨大的应用潜力。
[0046]在本发明中，我们用偏光显微镜对单个金纳米棒进行了成像。研宄结果表明:偏光显微镜只能够监测具有光去极化功能的各向异性的金纳米颗粒，而暗场场显微镜没有这种选择性，单个各向异性的金纳米棒能够被偏光显微镜选择性的观测到，但是球状的金纳米颗粒如果不形成团聚体是看不到的。偏光显微镜用于单个金纳米棒成像有几个特点:首先:偏光显微镜能够明显降低环境的背景；第二:偏光显微镜下光点的直径要比暗场显微镜下的要小；第三:虽然金纳米棒的乐强不同，但是信噪比得到明显的增加；最后:细胞环境下的金纳米棒被清晰地观察到。金纳米棒与偏光显微镜的联合应用在癌症检测和开发新的传感器方面具有十分重要意义。
[0047]尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。
【主权项】
1.一种采用偏光显微镜观测纳米颗粒用于细胞成像的方法，其特征在于:所述方法的具体步骤如下: 1)将细胞置于放置了玻片的塑料培养皿中，注入高糖DMEM培养基，使用1%的青霉素-链霉素，10%的牛血清在37°C、5% 0)2环境中进行培养； 2)培养24h后，采用新的高糖DMEM培养基替换，并加入40ul抗体修饰的金纳米棒溶液，再培养4h ； 3)将盖玻片从培养皿中取出并倒置于载玻片上进行观察，成像使用OlympusBX51显微镜，显微镜装置100W的卤素钨灯、一个NA值为1.25-1.36的油浸式聚光镜、40倍的平场消色差聚光镜和型号为Olympus DP73的彩色(XD，盖上盖玻片后，快速置于偏光显微镜下进行观察，当偏光显微镜用于颗粒成像时，起偏器应缓慢地旋转直至视场完全变黑，再逐渐调节焦面来找到金纳米棒，拍照时采用400ms的曝光时间。
2.如权利要求1所述的一种采用偏光显微镜观测纳米颗粒用于细胞成像的方法，其特征在于:所述2)部步骤中抗体修饰的金纳米棒溶液的制备方法如下: 1)合成金纳米颗粒种子:在血清瓶中，将48μ L 0.1M冰的硼氢化钠注入含有0.1MCTAB和0.00025Μ的HAuCl44mL溶液中，应用前溶液需在28°C溶液中静置2h以上； 2)在20mL 的 0.1M CTAB 溶液中，依次加入 426 μ L 24.28mM 的 HAuCl4、0.5ml 4mM的AgNOjP 105 μ L 0.1M的ΑΑ，待溶液从黄色转化为无色时，加入60 μ L种子溶液并振荡20-30s ;然后在溶液中静置4h以上；最后，将3ml新合成的金纳米棒溶液加入到20ml含有.0.1M CTAB, 80 μ L 24.28mM HAuCljP 185 μ L 0.1M AA 溶液中，溶液振荡 30s 后静置 2h，得到的产品在1000rpm下离心并去除上清液两次，新制备的金纳米棒用紫外可见和透射电子显微镜进行表征。 3)球状纳米颗粒按照以下方法合成:2mL24.28mM HAuCl4加入到93mL去离子水中，在回流状态下将溶液加热至沸腾，然后加入5mL I %的柠檬酸钠溶液，并继续加热.30min，待溶液冷却至室温，得到40nm的金纳米颗粒，样品用紫外可见和透射电子显微镜进行表征。
【专利摘要】本发明公开了一种采用偏光显微镜观测纳米颗粒用于细胞成像的方法，本发明采用偏光显微镜观察单个金纳米棒，发现偏光显微镜能够对各向异性的纳米材料进行选择性成像，在偏光显微镜下，金纳米棒的散射光点具有较小的尺寸，能够显著降低成像的背景值，相应地图像的信噪比得到至少3倍以上的改善。由于这种独特的光学性能，各向异性纳米材料和偏光显微镜在癌细胞成像和检测中有着巨大的应用潜力。
【IPC分类】C12Q1-02
【公开号】CN104711314
【申请号】CN201510061062
【发明人】李乐, 金鑫, 贺志红
【申请人】李乐, 贺志红, 湖南伊鸿健康科技有限公司
【公开日】2015年6月17日
【申请日】2015年2月5日