包含二十二碳六烯酸的提取的植物脂质的制作方法_3

文档序号:8407619阅读:来源:国知局
选的实施方案中,脂质或油,优选为种子油,具有以下特征:在脂质或 油的总脂肪酸含量中,DHA的水平为约20. 1%与30%之间或者约20. 1%与35%之间,优选 地为30%与35%之间,棕榈酸的水平为约2%与约16%之间,肉豆蘧酸的水平小于约6%并 且优选小于1%,油酸的水平为约1%与约30%之间,LA的水平为约4%与约35%之间,ALA 为存在的,GLA为存在的,SDA的水平为约0.05%与约10%之间,ETA的水平为小于约6%, EPA的水平为约0. 05%与约10%之间,DPA的水平为约0. 05%与约8%之间。
[0112] 在另一个实施方案中,所述种子包含每克种子至少约18mg、至少约22mg、至少约 26mg、约18mg与约IOOmg之间、约22mg与约70mg之间、约80mg、约30mg与约80mg之间或 者约24mg与约50mg之间的DHA。
[0113] 在以上方面的另一个实施方案中,所述植物部分如种子包含编码以下几组酶之一 的外源多核苷酸;
[0114] i) ω 3-去饱和酶、Λ 6-去饱和酶、Λ 5-去饱和酶、Λ 4-去饱和酶、Λ 6-延伸酶以 及Λ 5-延伸酶;
[0115] ii) Λ 15-去饱和酶、Λ 6-去饱和酶、Λ 5-去饱和酶、Λ 4-去饱和酶、Λ 6-延伸酶 以及Λ 5-延伸酶;
[0116] iii) Λ 12-去饱和酶、Λ 6-去饱和酶、Λ 5-去饱和酶、Λ 4-去饱和酶、Λ 6-延伸酶 以及Λ 5-延伸酶;
[0117] iv) Λ 12-去饱和酶、ω 3-去饱和酶和/或Λ 15-去饱和酶、Λ 6-去饱和酶、Λ 5-去 饱和酶、Λ 4-去饱和酶、Λ 6-延伸酶以及Λ 5-延伸酶;
[0118] V) ω 3-去饱和酶、Λ 8-去饱和酶、Λ 5-去饱和酶、Λ 4-去饱和酶、Λ 9-延伸酶以 及Λ 5-延伸酶;
[0119] vi) Λ 15-去饱和酶、Λ 8-去饱和酶、Λ 5-去饱和酶、Λ 4-去饱和酶、Λ 9-延伸酶 以及Λ 5-延伸酶;
[0120] vii) Λ 12-去饱和酶、Λ 8-去饱和酶、Λ 5-去饱和酶、Λ 4-去饱和酶、Λ 9-延伸酶 以及Λ 5-延伸酶;
[0121] viii) Λ 12-去饱和酶、ω 3-去饱和酶和/或Λ 15-去饱和酶、Λ 8-去饱和酶、 Λ 5-去饱和酶、Λ 4-去饱和酶、Λ 9-延伸酶以及Λ 5-延伸酶;
[0122] 并且其中每种多核苷酸可操作地连接至能够在植物部分的细胞内指导所述多核 苷酸表达的一个或多个启动子。
[0123] 在一个实施方案中,Λ 12-去饱和酶也具有ω 3-去饱和酶和/或Λ 15-去饱和酶 活性,即,通过单一多肽赋予所述活性。或者,所述Λ12-去饱和酶不具有ω3_去饱和酶活 性并且不具有Λ 15-去饱和酶活性,即所述Λ 12-去饱和酶为与具有ω 3-去饱和酶活性和 /或Λ 15-去饱和酶的多肽不同的多肽。
[0124] 在以上方面的另一个实施方案中,植物部分如种子或重组细胞具有以下特征中的 一个或多个或所有:
[0125] i) Λ 12-去饱和酶在植物部分的一种或多种细胞中或在重组细胞中以至少约 60%、至少约70%、至少约80%、约60%与约95%之间、约70%与约90%之间或者约75% 与约85%之间的效率将油酸转化为亚油酸;
[0126] ii) ω3-去饱和酶在植物部分的一种或多种细胞中或在重组细胞中以至少约 65%、至少约75%、至少约85%、约65%与约95%之间、约75%与约91 %之间或者约80% 与约91%之间的效率将ω6脂肪酸转化为ω3脂肪酸;
[0127] iii) Λ 6-去饱和酶在植物部分的一种或多种细胞中或在重组细胞中以至少约 20 %、至少约30 %、至少约40 %、至少约50 %、至少约60 %、至少约70 %、约30 %与约70 % 之间、约35%与约60%之间或者约50%与约70%之间的效率将ALA转化为SDA ;
[0128] iv) Λ6-去饱和酶在植物部分的一种或多种细胞中或在重组细胞中以小于约 5 %、小于约2. 5 %、小于约1 %、约0. 1 %与约5 %之间、约0. 5 %与约2. 5 %之间或者约 0. 5%与约1 %之间的效率将亚油酸转化为Y-亚麻酸;
[0129] V) Λ6-延伸酶在植物部分的一种或多种细胞中或在重组细胞中以至少约60%、 至少约70%、至少约75%、约60%与约95%之间、约70%与约80%之间或者约75%与约 80%之间的效率将SDA转化为ETA ;
[0130] vi) Λ 5-去饱和酶在植物部分的一种或多种细胞中或在重组细胞中以至少约 60%、至少约70%、至少约75%、至少约80%、至少约90%、约60%与约95%之间、约70% 与约95%之间或者约75%与约95%之间的效率将ETA转化为EPA ;
[0131] vii) Λ5-延伸酶在植物部分的一种或多种细胞中或在重组细胞中以至少约 80 %、至少约85 %、至少约90 %、约50 %与约90 %之间或者约85 %与约95 %之间的效率将 EPA转化为DPA ;
[0132] viii) Λ4-延伸酶在植物部分的一种或多种细胞中或在重组细胞中以至少约 80%、至少约90%、至少约93%、约50%与约95%之间、约80%与约95%之间或者约85% 与约95%之间的效率将DPA转化为DHA ;
[0133] ix)在植物部分的一种或多种细胞中或在重组细胞中油酸转化为DHA的效率为至 少约10%、至少约15%、至少约20%、至少约25%、约20%、约25%、约30%、约10%与约 50%之间、约10%与约30%之间、约10%与约25%之间或者约20%与约30%之间;
[0134] X)在植物部分的一种或多种细胞中或在重组细胞中LA转化为DHA的效率为至少 约15 %、至少约20 %、至少约22 %、至少约25 %、至少约30 %、约25 %、约30 %、约35 %、约 15%与约50%之间、约20%与约40%之间或者约20%与约30%之间;
[0135] xi)在植物部分的一种或多种细胞中或在重组细胞中ALA转化为DHA的效率为至 少约17%、至少约22%、至少约24%、至少约30%、约30%、约35%、约40%、约17%与约 55%之间、约22%与约35%之间或者约24%与约35%之间;
[0136] xii)植物部分的一种或多种细胞或者重组细胞包含至少约25%、至少约30%、约 25%与约40%之间或者约27. 5%与约37. 5%之间的比缺乏外源多核苷酸的对应细胞更多 的ω 3脂肪酸;
[0137] xiii) Λ 6-去饱和酶优选地将α -亚麻酸(ALA)相对于亚油酸(LA)去饱和;
[0138] xiv) Λ 6-延伸酶也具有Λ 9-延伸酶活性;
[0139] XV) Λ 12-去饱和酶也具有Λ 15-去饱和酶活性;
[0140] xvi) Λ 6-去饱和酶也具有Λ 8-去饱和酶活性;
[0141] xvii) Λ 8-去饱和酶也具有Λ 6-去饱和酶活性或者不具有Λ 6-去饱和酶活性;
[0142] xvi ii) Λ 15-去饱和酶也具有对GLA的ω 3-去饱和酶活性;
[0143] xix) ω 3-去饱和酶也具有对LA的Λ 15-去饱和酶活性;
[0144] XX) ω 3-去饱和酶将LA和/或GLA二者去饱和;
[0145] xxi) ω 3-去饱和酶优选地将GLA相对于LA去饱和;
[0146] xxii)所述去饱和酶中的一种或多种或所有,优选为Λ 6-去饱和酶和/或Λ 5-去 饱和酶,对酰基-CoA底物具有比对应酰基-PC底物更大的活性;
[0147] xxiii) Λ6-去饱和酶对作为脂肪酸底物的ALA具有比对LA更大的Λ6-去饱和酶 活性;
[0148] xxiv) Λ 6-去饱和酶对作为脂肪酸底物的ALA-CoA具有比对作为脂肪酸底物的连 接到PC的sn-2位置的ALA更大的Λ 6-去饱和酶活性;
[0149] XXV)相对于LA,Λ 6-去饱和酶对作为底物的ALA具有大至少约2倍的Λ 6-去饱 和酶活性、大至少3倍的活性、大至少4倍的活性或者大至少5倍的活性;
[0150] xxvi) Λ 6-去饱和酶对作为脂肪酸底物的ALA-CoA具有比对作为脂肪酸底物的连 接到PC的sn-2位置的ALA更大的活性;
[0151] xxvii) Λ 6-去饱和酶对作为脂肪酸底物的ALA-CoA具有比对作为脂肪酸底物的 连接到PC的sn-2位置的ALA大至少约5倍的Λ 6-去饱和酶活性或者大至少10倍的活 性;
[0152] xxviii)所述去饱和酶为前端去饱和酶;以及
[0153] xxix) Λ 6-去饱和酶对ETA没有可检测的Λ 5-去饱和酶活性。
[0154] 在以上方面的另一个实施方案中,植物部分如种子或重组细胞具有以下特征中的 一个或多个或所有:
[0155] i) Λ 12-去饱和酶包含具有如SEQ ID NO : 10所提供的序列、其生物活性片段或者 与SEQ ID NO : 10至少50 %相同的氨基酸序列的氨基酸;
[0156] ii) ω 3-去饱和酶包含具有如SEQ ID NO :12所提供的序列、其生物活性片段或者 与SEQ ID NO : 12至少50 %相同的氨基酸序列的氨基酸;
[0157] iii) Λ 6-去饱和酶包含具有如SEQ ID NO :16所提供的序列、其生物活性片段或 者与SEQ ID NO : 16至少50 %相同的氨基酸序列的氨基酸;
[0158] iv) Λ6-延伸酶包含具有如SEQ ID NO :25所提供的序列、其生物活性片段(如SEQ ID NO :26)或者与SEQ ID NO :25和/或SEQ ID NO :26至少50%相同的氨基酸序列的氨 基酸;
[0159] V) Λ 5-去饱和酶包含具有如SEQ ID NO : 30所提供的序列、其生物活性片段或者 与SEQ ID NO :30至少50%相同的氨基酸序列的氨基酸;
[0160] vi) Λ 5-延伸酶包含具有如SEQ ID NO :37所提供的序列、其生物活性片段或者与 SEQ ID NO :37至少50 %相同的氨基酸序列的氨基酸;以及
[0161] vii) Λ 4-去饱和酶包含具有如SEQ ID NO :41所提供的序列、其生物活性片段或 者与SEQ ID NO :41至少50%相同的氨基酸序列的氨基酸。
[0162] 在以上方面的一个实施方案中,植物部分(如种子)或者重组细胞另外包含编码 以下各项的外源多核苷酸:二酰甘油酰基转移酶(DGAT)、单酰甘油酰基转移酶(MGAT)、甘 油-3-磷酸酰基转移酶(GPAT)、1-酰基-甘油-3-磷酸酰基转移酶(LPAAT)(优选为可使用 C22多元不饱和脂肪酰基-CoA底物如DHA-CoA和/或DPA-CoA的LPAAT)、酰基-CoA :溶血 磷脂酰胆碱酰基转移酶(LPCAT)、磷脂酶A2 (PLA2)、磷脂酶C (PLC)、磷脂酶D (PLD)、CDP-胆 碱二酰甘油胆碱磷酸转移酶(CPT)、磷脂酰胆碱二酰甘油酰基转移酶(PDAT)、磷脂酰胆碱: 二酰甘油胆碱磷酸转移酶(PDCT)、酰基-CoA合成酶(ACS)或其两种或更多种的组合。
[0163] 在以上方面的另一个实施方案中,植物部分(如种子)或重组细胞另外包含在植 物部分的细胞中下调选自以下的外源性酶的产生和/或活性的引入性突变或外源性多核 苷酸:FAE1、DGAT、MGAT、GPAT、LPAAT、LPCAT、PLA 2、PLC、PLD、CPT、PDAT、如FATB的硫酯酶或 者Λ 12-去饱和酶或者其两种或更多种的组合。
[0164] 在另一个实施方案中,所述启动子中的至少一个或所有为种子特异性启动子。在 一个实施方案中,从油生物合成或积累基因如编码油质蛋白的基因中或者从种子储藏蛋白 基因如编码conlinin的基因中获得所述启动子中的至少一个或所有。
[0165] 在另一个实施方案中,指导编码Δ 4_去饱和酶和Δ 5_延伸酶的外源性多核苷 酸的表达的所述一个或多个启动子在所述一个或多个启动子指导编码△ 12-去饱和酶和 ω 3-去饱和酶的外源性多核苷酸的表达之前开始所述多核苷酸在植物的发育种子或重组 细胞中的表达,或者在此之前达到峰值表达。
[0166] 在另一个实施方案中,外源性多核苷酸在整合到植物部分的细胞或者重组细胞的 基因组中的DNA分子(优选为T-DNA分子)中共价连接,并且优选地为其中整合到植物部 分的细胞或重组细胞的基因组中的此类DNA分子的数量不超过一个、两个或三个,或者为 两个或三个。
[0167] 在另一个实施方案中,所述植物部分包含至少两种不同的外源性多核苷酸,它们 各自编码具有相同或不同氨基酸序列的△ 6-去饱和酶。
[0168] 在另一个实施方案中,包含外源性多核苷酸的植物部分的总油含量为缺乏外源 性多核苷酸的对应植物部分的总油含量的至少约40%、至少约50%、至少约60%、至少约 70%、约50%与约80%之间或者约80%与约100%之间。在另一个实施方案中,包含外源性 多核苷酸的种子具有缺乏外源性多核苷酸的对应种子的重量的至少约40%、至少约50%、 至少约60%、至少约70%、约50%与约80%之间或者约80%与约100%之间的种子重量。
[0169] 在以上方面的另一个实施方案中,脂质为油的形式,优选为来自含油种子的种子 油,并且其中按重量计脂质的至少约90%、至少约95%、至少约98%或者约95%与约98% 之间为三酰甘油。
[0170] 还提供一种用于产生提取的植物脂质的方法,所述方法包括以下步骤:
[0171] i)获得包含脂质的植物部分,所述脂质包含酯化形式的脂肪酸,其中对于提取的 脂质,所述脂质具有如本文所定义的脂肪酸组成。在一个实施方案中,所述脂肪酸包含油 酸、棕榈酸、含有亚油酸(LA)的ω 6脂肪酸、含有α -亚麻酸(ALA)和二十二碳六烯酸(DHA) 的ω3脂肪酸以及十八碳四烯酸(SDA)、二十碳五烯酸(EPA)、二十二碳五烯酸(DPA)和 二十碳四烯酸(ETA)中的一种或多种,其中(i)DHA在所提取的脂质的总脂肪酸含量中的水 平为20. 1%与30%之间或者20. 1%与35%之间,优选为30%与35%之间,(ii)棕榈酸在 所提取的脂质的总脂肪酸含量中的水平为2%与16%之间,(iii)肉豆蘧酸(C14:0)在所提 取的脂质的总脂肪酸含量中的水平为小于6%,优选小于1%,(iv)油酸在所提取的脂质的 总脂肪酸含量中的水平为1%与30%之间,(V)亚油酸(LA)在所提取的脂质的总脂肪酸含 量中的水平为4%与35%之间,(vi) α -亚麻酸(ALA)在所提取的脂质的总脂肪酸含量中 的水平为4%与40%之间,(vii)二十碳三烯酸(ETrA)在所提取的脂质的总脂肪酸含量中 的水平为小于4%,(viii)总饱和脂肪酸在所提取的脂质的总脂肪酸含量中的水平为4% 与25%之间,(ix)在所提取的脂质的脂肪酸含量中总ω6脂肪酸:总ω3脂肪酸的比率为 0. 05与1之间,(X)脂质的三酰甘油(TAG)含量为至少70%,并且(xi)以TAG形式酯化的 至少70 % DHA处于TAG的sn-Ι或sn-3位置;以及
[0172] ii)从所述植物部分提取脂质;
[0173] 其中DHA在所提取的脂质的总脂肪酸含量中的水平为约20. 1 %与30%之间或者 20. 1%与35%之间,优选地为30%与35%之间。优选地,以TAG形式酯化的至少81%或 至少90% DHA处于TAG的sn-Ι或sn-3位置。
[0174] 还提供使用本发明的方法产生的脂质或含有所述脂质的油。
[0175] 在另一方面,本发明提供一种用于产生多元不饱和脂肪酸甲酯或乙酯的方法,所 述方法包括在所提取的植物脂质中或者在提取过程期间将三酰甘油分别与甲醇或乙醇反 应,其中提取的植物脂质包含以TAG形式酯化的脂肪酸,所述脂肪酸包含油酸、棕榈酸、含 有亚油酸(LA)的ω6脂肪酸、含有α-亚麻酸(ALA)和二十二碳六烯酸(DHA)的ω3脂 肪酸以及任选地十八碳四烯酸(SDA)、二十碳五烯酸(EPA)、二十二碳五烯酸(DPA)和二十 碳四烯酸(ETA)中的一种或多种,其中DHA在所提取的脂质的总脂肪酸含量中的水平为约 20. 1%与30%之间或者20. 1%与35%之间,优选为30%与35%之间,从而产生多元不饱和 脂肪酸甲酯或乙酯。
[0176] 在另一方面,本发明提供一种用于产生多元不饱和脂肪酸甲酯或乙酯的方法,所 述方法包括在所提取的植物脂质中或者在提取过程期间将三酰甘油分别与甲醇或乙醇反 应,其中提取的植物脂质包含以TAG形式酯化的脂肪酸,所述脂肪酸包含油酸、棕榈酸、含 有亚油酸(LA)的ω6脂肪酸、含有α-亚麻酸(ALA)和二十二碳六烯酸(DHA)的ω3脂肪 酸以及任选地十八碳四烯酸(SDA)、二十碳五烯酸(EPA)和二十碳四烯酸(ETA)中的一种或 多种,其中DHA在所
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