所述地存在。
[0320] 如本文所用的术语"脂肪酸"是指通常具有长脂肪族尾部的饱和或不饱和的羧酸 (或有机酸）。通常脂肪酸具有至少8个碳原子长度、更优选为至少12个碳长度的碳碳连 接链。本发明的优选脂肪酸具有18-22个碳原子（C18、C20、C22脂肪酸）、更优选为20-22 个碳原子（C20、C22)以及最优选为22个碳原子（C22)的碳链。大部分天然发生的脂肪酸 具有偶数个碳原子，因为其生物合成涉及具有两个碳原子的乙酸酯。脂肪酸可处于游离状 态（非酯化）或处于酯化形式如甘油三酯、二酰甘油、单酰甘油、酰基-CoA(硫酯）结合或 其它结合形式的部分。脂肪酸可酯化为磷脂，如磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸、 磷脂酰甘油、磷脂酰肌醇或二磷脂酰甘油形式。在一个实施方案中，脂肪酸与甲基或乙基酯 化，例如C20或C22PUFA的甲酯或乙酯。优选的脂肪酸为EPA、DPA或DHA的甲酯或乙酯或 者混合物EPA和DHA或者EPA、DPA和DHA或者EPA和DPA。
[0321] "饱和的脂肪酸"不包含沿着链的任何双键或其它官能团。术语"饱和的"是指氢， 即所有碳（除羧酸[-C00H]基之外）包含尽可能多的氢。换言之，Ω (ω)端包含3个氢 (CH3-)并且链中的每个碳包含2个氢（-CH2-)。
[0322] "不饱和脂肪酸"具有饱和脂肪酸的类似形式，除了沿着链存在一个或多个烯烃官 能团之外，其中每个烯烃用双键"-CH = CH-"部分（即，与另一个碳双键结合的碳）取代所 述链的单键"-CH2-CH2-"部分。链中结合双键的任一端的两个贴近的碳原子出现顺式或反 式构型，优选为顺式构型。在一个实施方案中，本发明的脂质或油具有脂肪酸组合物，所述 组合物包含少于1 %具有反式构型的碳碳双键的脂肪酸（反式脂肪酸）。
[0323] 如本文所用的术语"单元不饱和脂肪酸"是指在其碳链上包含至少12个碳原子并 且在所述链中仅包含一个烯烃基（碳碳双键）的脂肪酸。如本文所用的术语"多元不饱和 脂肪酸"或"PUFA"是指在其碳链上包含至少12个碳原子和至少两个烯烃基（碳碳双键） 的脂肪酸。
[0324] 如本文所用的术语"长链多元不饱和脂肪酸"和"LC-PUFA"是指在其碳链上包含 至少20个碳原子和至少两个碳碳双键的脂肪酸并因此包括VLC-PUFA。如本文所用的术语 "极长链多元不饱和脂肪酸"和"VLC-PUFA"是指在其碳链上包含至少22个碳原子和至少 三个碳碳双键的脂肪酸。通常，脂肪酸碳链中的碳原子数目是指未支化的碳链。如果碳链 为支化的，则碳原子数目排除侧基中的那些碳原子。在一个实施方案中，长链多元不饱和脂 肪酸为ω3脂肪酸，即，在从脂肪酸的甲基端开始的第三个碳碳键具有去饱和作用（碳碳双 键）。在另一个实施方案中，长链多元不饱和脂肪酸为ω6脂肪酸，即，在从脂肪酸的甲基 端开始的第六个碳碳键具有去饱和作用（碳碳双键）。在另一个实施方案中，长链多元不 饱和脂肪酸选自由以下组成的组：花生四烯酸（ARA，20 :4 Λ 5,8,11，14 ;ω 6)、二十碳四烯 酸（ΕΤΑ，20 :4Λ8，11，14，17, ω3)、二十碳五烯酸（ΕΡΑ，20 :5Λ5,8，11，14，17 ;ω3)、二十二 碳五烯酸（DPA，22 :5 Λ 7,10,13,16,19, ω 3)或者二十二碳六烯酸（DHA，22 :6 Λ 4, 7,10,13， 16,19, ω 3)。LC-PUFA还可为二高-γ-亚油酸（DGLA)或二十碳三烯酸（ETrA，20 :3Λ 11， 14，17, ω3)。显而易见的是，根据本发明产生的LC-PUFA可为任何或所有以上的混合物并 且可包括其它LC-PUFA或任何这些LC-PUFA的衍生物。在一个优选的实施方案中，ω 3脂 肪酸为至少DHA，优选为DPA和DHA或者EPA、DPA和DHA。如从植物中提取的，DHA以总脂 肪酸组合物的20. 1 % -30 %或20. 1 %与35 %之间，优选30 %与35 %之间的水平存在于脂 质或油中。例如，DHA以总脂肪酸组合物的30. 1%与35%之间的水平存在。在一个实施方 案中，DHA的水平大于DPA的水平，更优选为大于EPA和DPA各自的水平，最优选为大于EPA 和DPA的组合水平。
[0325] 此外，如本文所用的术语"长链多元不饱和脂肪酸"（LC-PUFA)和"极长链多元不 饱和脂肪酸"（VLC-PUFA)是指处于游离状态（非酯化的）或处于酯化形式的脂肪酸，如甘 油三酯（三酰甘油）、二酰甘油、单酰甘油、酰基-CoA结合或其它结合形式的部分。在甘油 三酯中，LC-PUFA或VLC-PUFA (如DHA)可在sn-1/3或sn-2位置上酯化，或者甘油三酯可 包含选自LC-PUFA和VLC-PUFA酰基的两个或三个酰基。例如，甘油三酯可在sn-Ι和sn-3 两个位置上包含DHA。脂肪酸可酯化为磷脂，如磷脂酰胆碱（PC)、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝 氨酸、磷脂酰甘油、磷脂酰肌醇或二磷脂酰甘油形式。因此，LC-PUFA作为混合物形式存在于 细胞的脂质中或从细胞、组织或有机体中提取的纯化油或脂质中。在优选的实施方案中，本 发明提供包含至少75 %或至少85 %三酰甘油的油，其中其余部分作为其它形式的脂质（如 提及的那些）存在，其中至少所述三酰甘油包含LC-PUFA。随后，可例如通过用强碱水解来 释放游离脂肪酸或者通过酯基转移作用、分馏等进一步纯化或处理油。
[0326] 如本文所用的，"总ω6脂肪酸"或"总ω6脂肪酸含量"等是指在所提取的脂质、 油、重组细胞、植物部分或种子中的酯化和非酯化的所有ω6脂肪酸的总量，如上下文所确 定的，其表示为占总脂肪酸含量的百分比。这些ω6脂肪酸包括（如果存在的话）LA、GLA、 061^4狀304和〇3 6-0?4，并且排除任何〇3 3脂肪酸和单元不饱和脂肪酸。存在于本发明 的植物、种子、脂质或油中的ω6脂肪酸全部包括在多元不饱和脂肪酸（PUFA)的类别中。
[0327] 如本文所用的，"新ω6脂肪酸"或"新ω6脂肪酸含量"等是指在所提取的脂质、 油、重组细胞、植物部分或种子中的酯化和非酯化的排除LA的所有ω 6脂肪酸的总量，如上 下文所确定的，其表示为占总脂肪酸含量的百分比。这些新ω6脂肪酸为在本发明的细胞、 植物、植物部分和种子中通过表达引入到细胞中的遗传构建体（外源性多核苷酸）来产生 的脂肪酸，并且包括（如果存在的话）61^、061^4狀404和〇3 6-0?八，但排除1^和任何〇3 3 脂肪酸以及单元不饱和脂肪酸。示例性总ω6脂肪酸含量和新ω6脂肪酸含量通过将样品 中的脂肪酸转化为FAME并通过GC进行分析来确定，如实施例1所述的。
[0328] 如本文所用的，"总ω3脂肪酸"或"总ω3脂肪酸含量"等是指在所提取的脂质、 油、重组细胞、植物部分或种子中的酯化和非酯化的所有ω 3脂肪酸的总量，如上下文所确 定的，其表示为占总脂肪酸含量的百分比。这些ω3脂肪酸包括（如果存在的话）ALA、SDA、 ETrA、ETA、EPA、DPA和DHA，并且排除任何ω6脂肪酸和单元不饱和脂肪酸。存在于本发明 的植物、种子、脂质或油中的ω3脂肪酸全部包括在多元不饱和脂肪酸（PUFA)的类别中。
[0329] 如本文所用的，"新ω3脂肪酸"或"新ω3脂肪酸含量"等是指在所提取的脂质、 油、重组细胞、植物部分或种子中的酯化和非酯化的排除ALA的所有ω 3脂肪酸的总量，如 上下文所确定的，其表示为占总脂肪酸含量的百分比。这些新ω3脂肪酸为在本发明的细 胞、植物、植物部分和种子中通过表达引入到细胞中的遗传构建体（外源性多核苷酸）来产 生的ω 3脂肪酸，并且包括（如果存在的话）SDA、ETrA、ETA、EPA、DPA和DHA，但排除ALA和 任何ω6脂肪酸以及单元不饱和脂肪酸。示例性总ω3脂肪酸含量和新ω3脂肪酸含量通 过将样品中的脂肪酸转化为FAME并通过GC进行分析来确定，如实施例1所述的。
[0330] 如技术人员将了解的，在本发明的方法中作为步骤的术语"获得植物部分"可 包括获得用于在所述方法中使用的一种或多种植物部分。获得植物部分包括如使用 机械收割机从植物中收获植物部分或者从供应商购买植物部分或者接收植物部分。 在另一个实施例十.掙植物#分可为认拥有收荘棺物部分的一胜他人荘取 植物。
[0331] 可用于本发明中的去饱和酶、延伸酶和酰基转移酶蛋白以及编码它们的基因为本 领域已知的那些中的任一种或者为其同系物或衍生物。此类基因和编码的蛋白质大小的实 例在表1中列出。已显示参与LC-PUFA生物合成的去饱和酶全部属于所谓"前端"去饱和 酶组。优选的蛋白质或蛋白质的组合为通过在本文中提供为SEQ ID NO : 1-7的遗传构建体 所编码的那些。
[0332] 如本文所用的，术语"前端去饱和酶"是指在脂质的酰基链的羧基与预先存在的不 饱和部分之间引入双键的一类酶的成员，其结构性特征在于N-端细胞色素 b5结构域连同 包含三个高度保守的组氨酸盒的典型脂肪酸去饱和酶结构域的存在（Napier等，1997)。
[0333] 用于本发明的任何延伸酶或去饱和酶的活性可通过在细胞例如像植物细胞中或 者优选在体细胞胚或转基因植物中表达编码所述酶的基因并且确定所述细胞、胚或植物 与其中不表达酶的可比较性细胞、胚或植物相比是否具有增加的产生LC-PUFA的能力来测 试。
[0334] 在一个实施方案中，用于本发明的去饱和酶和/或延伸酶中的一种或多种可从微 藻中纯化，即，氨基酸序列与可从微藻中纯化的多肽相同。
[0335] 虽然某些酶在本文中特别描述为"双功能"，但是这个术语的缺乏不一定暗示特定 酶不具有除特别定义的活性之外的活性。
[0336] 去饱和酶
[0337] 如本文所用的，术语"去饱和酶"是指能够将碳碳双键引入通常为酯化形式的脂肪 酸底物（例如像，酰基-CoA酯）的酰基中的酶。酰基可与磷脂酯化，如磷脂酰胆碱（PC)，或 者与酰基载体蛋白（ACP)酯化，或者在一个优选的实施方案中，与CoA酯化。因此，去饱和 酶通常分为三组。在一个实施方案中，去饱和酶为前端去饱和酶。
[0338]
【主权项】
1. 一种用于产生提取的植物脂质的方法，所述方法包括以下步骤： i) 获得植物部分，其脂质包含酯化形式的脂肪酸，所述脂肪酸包含油酸、棕榈酸、包括 亚油酸（LA)的《6脂肪酸、包括a-亚麻酸（ALA)和二十二碳六烯酸（DHA)的《3脂肪酸 以及任选地十八碳四烯酸（SDA)、二十碳五烯酸（EPA)、二十二碳五烯酸（DPA)和二十碳四 烯酸（ETA)中的一种或多种，其中DHA在所提取的脂质的总脂肪酸含量中的水平为20. 1% 与35%之间，其中棕榈酸在所提取的脂质的总脂肪酸含量中的水平为2%与16%之间，并 且其中肉豆蘧酸（C14:0)在所提取的脂质的总脂肪酸含量中的水平小于1%;以及 ii) 从所述植物部分提取脂质； 其中DHA在所提取的脂质的总脂肪酸含量中的水平为20. 1%与35%之间。
2. 如权利要求1所述的方法，其中所提取的植物脂质具有以下特征中的一个或多个或 所有： i) 棕榈酸在所提取的植物脂质的总脂肪酸含量中的水平为2%与15%之间； ii) 肉豆蘧酸（C14:0)在所提取的植物脂质的总脂肪酸含量中的水平为约0. 1% ; iii) 油酸在所提取的植物脂质的总脂肪酸含量中的水平为1%与30%之间； iv) 亚油酸（LA)在所提取的植物脂质的总脂肪酸含量中的水平为4%与20%之间； V)a-亚麻酸（ALA)在所提取的植物脂质的总脂肪酸含量中的水平为4%与40%之 间； vi) Y-亚麻酸（GLA)在所提取的植物脂质的总脂肪酸含量中的水平为0. 05%与7%之 间； vii) 十八碳四烯酸（SDA)在所提取的植物脂质的总脂肪酸含量中的水平为0.05%与 10%之间； viii) 二十碳四烯酸（ETA)在所提取的植物脂质的总脂肪酸含量中的水平小于6% ; ix) 二十碳三烯酸（ETrA)在所提取的植物脂质的总脂肪酸含量中的水平小于4% ; X)所提取的植物脂质在其脂肪酸含量中包含小于〇. 1 %的《6-二十二碳五烯酸 (22:5A4,7，10，13，16); xi) 新《6脂肪酸在所提取的植物脂质的总脂肪酸含量中的水平小于10% ; xii) 总《6脂肪酸：总《3脂肪酸在所提取的植物脂质的脂肪酸含量中的比率为1.0 与3.0之间或者0. 1与1之间； xiii) 新《6脂肪酸：新《3脂肪酸在所提取的植物脂质的脂肪酸含量中的比率为I. 0 与3. 0之间、0. 02与0. 1之间或者0. 1与1之间； xiv) 所提取的植物脂质的脂肪酸组成是基于至少10%的油酸至DHA的转化效率； XV)所提取的植物脂质的脂肪酸组成是基于至少15%的LA至DHA的转化效率； xvi) 所提取的植物脂质的脂肪酸组成是基于至少17%的ALA至DHA的转化效率； xvii) 所提取的植物脂质中的总脂肪酸具有小于I. 5%C20:1 ; xviii) 所提取的植物脂质的三酰甘油（TAG)含量为至少70% ; xix) 所提取的植物脂质包含含有DHA的二酰甘油（DAG); XX)所提取的植物脂质包含小于10%游离（未酯化的）脂肪酸和/或磷脂，或者基本 上不包含它们； xxi)以TAG形式酯化的至少70%DHA处于所述TAG的sn-1或sn-3位置； XXii)在所提取的植物脂质中最丰富的含有DHA的TAG种类为DHA/18:3/18:3(TAG58:12);以及 xxiii)所提取的植物脂质包含三-DHATAG(TAG66:18)。
3. 如权利要求1或权利要求2所述的方法，其中二十碳五烯酸（EPA)在所提取的植物 脂质的总脂肪酸含量中的水平为〇. 05%与10%之间。
4. 如权利要求1或权利要求2所述的方法，其中二十二碳五烯酸（DPA)在所提取的植 物脂质的总脂肪酸含量中的水平小于4%。
5. 如权利要求1或权利要求2所述的方法，其中DHA在所提取的植物脂质的总脂肪酸 含量中的水平为20. 1%与30%之间。
6. 如权利要求1或权利要求2所述的方法，其中所提取的植物脂质为油的形式，其中按 所述油的重量计至少90 %为所述脂质。
7. 如权利要求1或权利要求2所述的方法，其中所提取的植物脂质为油的形式，所述油 包含I. 5mg甾醇/g油与约IOmg甾醇/g油之间。
8. 如权利要求7所述的方法，其中所提取的植物脂质包含菜油留醇/24-甲基胆固醇、 A5-豆甾醇、齿孔醇、3 -谷甾醇/24-乙基胆固醇、A5-燕麦甾醇/异岩藻甾醇、A7-豆 甾醇/豆甾-7-烯_3P-醇以及A7-燕麦甾醇中的一种或多种或所有，或者其具有与野生 型菜籽油基本上相同的留醇含量。
9. 如权利要求7所述的方法，其中所提取的植物脂质包含小于0. 5mg胆固醇/g油，或 者基本上不含胆固醇。
10. 如权利要求1或权利要求2所述的方法，其中所述植物部分是芸苔属物种种子。
11. 如权利要求10所述的方法,其中所述种子包含每克种子至少18mgDHA。
12. 如权利要求10或权利要求11所述的方法，其中所述植物部分的所述总油含量为野 生型植物部分的总油含量的至少40%。
13. 提取的植物脂质，其包含酯化形式的脂肪酸，所述脂肪酸包含油酸、棕榈酸、包括亚 油酸（LA)的《6脂肪酸、包括a-亚麻酸（ALA)和二十二碳六烯酸（DHA)的《3脂肪酸以及 任选地十八碳四烯酸（SDA)、二十碳五烯酸（EPA)、二十二碳五烯酸（DPA)和二十碳四烯酸 (ETA)中的一种或多种，其中DHA在所提取的植物脂质的总脂肪酸含量中的水平为20. 1% 与35%之间，其中棕榈酸在所提取的植物脂质的总脂肪酸含量中的水平为2%与16%之 间，并且肉豆蘧酸（C14:0)在所提取的植物脂质的总脂肪酸含量中的水平小于1%。
14. 如权利要求13所述的提取的植物脂质，其具有如权利要求2所定义的特征中的一 个或多个。
15. 如权利要求13或权利要求14所述的提取的植物脂质，其中二十碳五烯酸（EPA)在 所提取的植物脂质的总脂肪酸含量中的水平为〇. 05%与10%之间。
16. 如权利要求13或权利要求14所述的提取的植物脂质，其中二十二碳五烯酸（DPA) 在所提取的植物脂质的总脂肪酸含量中的水平小于4%。
17. 如权利要求13或权利要求14所述的提取的植物脂质，其中DHA在所提取的植物脂 质的总脂肪酸含量中的水平为20. 1%与30%之间。
18. 如权利要求13或权利要求14所述的提取的植物脂质，其为芸苔属物种种子。
【专利摘要】本发明涉及包含二十二碳六烯酸的提取的植物脂质，和用于产生提取的植物脂质的方法。
【IPC分类】C12N15-82, C11B1-00, A01H5-10, C12N15-54, C12N15-53
【公开号】CN104726473
【申请号】CN201410796297
【发明人】J·R·皮特里, S·P·辛格
【申请人】联邦科学技术研究组织, 粮食研究发展公司, 纽希德私人有限公司
【公开日】2015年6月24日
【申请日】2014年12月18日
【公告号】US20150166928, WO2015089587A1