一种天麻素的制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于医药或食品技术领域，具体涉及一种共生发酵法生产天麻素的方法。
【背景技术】
[0002] 天麻，又名赤箭、独摇芝等，是兰科天麻属多年生草本植物。根状茎肥厚，无绿叶， 蒴果倒卵状椭圆形，常以块茎或种子繁殖。其根茎入药用以治疗头晕目眩、肢体麻木、小儿 惊风等症，是名贵中药。
[0003] 天麻的有效成分之一为天麻素，天麻素有镇静、抗惊厥、抗炎及增强机体免疫功能 等作用。临床上广泛用于眩晕（美尼尔氏病、病毒性眩晕、神经痛等）、头痛（神经衰弱及 神经衰弱综合症、血管性头痛、紧张性头痛、脑外伤综合症、偏头痛等，以及癫痫的辅助治疗 等。
[0004] 目前天麻素的工艺化生产中，主要是两种：一类是从天麻中提取得到，一类是化学 合成得到；天麻素在天麻中含量只有〇. 1%，因此，从天麻中提取得到的方法，浪费了大量 的原药材，并且还耗费时间、能量和提取剂等，天麻素的产品在临床用量越来越大，提取效 率的提高也无法满足（天麻素在天麻含量低的原因，因此，从天麻提取得到天麻素的方法 已经无法满足市场需要；化学合成方法虽然能够满足产品的大量生产，但化学合成方法得 到天麻素因其安全性和环境污染等潜在风险，被研宄者和消费者关注。因此，研宄开发新的 制备方法获得天麻素，具有重要理论价值和实际科学意义。
【发明内容】
[0005] 基于上述原因，本发明人在多年研宄的基础上，得到一种新的天麻素的方法，该方 法采用将富产天麻素天麻内生菌和富产天麻素蜜环菌菌株接种于共生发酵培养基中发酵， 再从发酵产物中提取得到天麻素，该方法工艺简单，适合工业化生产，不会造成资源浪费以 及环境污染，以本发明制备方法得当的天麻素为原料，制备成注射液具有更好的稳定性。
[0006] 本发明通过下述技术方案实现的。
[0007] 一种天麻素的制备方法，该方法为：将富产天麻素天麻内生菌和富产天麻素蜜环 菌菌株接种于共生发酵培养基中发酵，再从发酵产物中提取得到天麻素。
[0008] 其中富产天麻素天麻内生菌的制备方法为：
[0009] 采集新鲜天麻的块茎、花茎、花或果实，在无菌条件下，用75%酒精消毒，无菌水冲 洗，吸干多余水分，分别切成〇.3cm*0. 3cm左右的小段或用无菌研钵磨成浆状，接种在查氏 培养基和PDA培养基上，在20-60°C恒温培养1-10天，获得天麻内生菌的微生物菌株，然后 用筛选培养基发酵实验，采用高效液相色谱定性检测发酵液中天麻素的含量，从中筛选出 富产天麻素天麻内生菌，备用；
[0010] 所述筛选培养基为：葡萄糖l-50g/L、酵母膏l-10g/L、蛋白胨l-10g/L、硫酸镁 0? l-10g/L、磷酸二氢钾 0? l-5g/L、蜜环菌汁 200-800ml/L。
[0011] 其中富产天麻素蜜环菌菌株的制备方法为：
[0012] 采集天麻生长点的菌材，将其在无菌条件下，用75%酒精消毒，无菌水冲洗，吸干 多余水分后分别切成0. 3cm*0. 3cm左右的小段或用无菌研钵磨成浆状，分别接种在查氏培 养基和PDA培养基上，在20-30°C恒温培养1-10天，长出微生物，用筛选培养基发酵实验， 利用高效液相色谱定性定量检测发酵液中天麻素的含量，从中筛选出富产天麻素蜜环菌菌 株，备用；
[0013] 所述筛选培养基为：葡萄糖l-50g/L、酵母膏l-10g/L、蛋白胨l-10g/L、硫酸镁 0? l-10g/L、磷酸二氢钾 0? l-5g/L、榛叶汁 200-800ml/L。
[0014] 其中天麻素的制备方法为：
[0015] (1)将富产天麻素蜜环菌菌株按照5-20%的体积比接种到共生发酵培养基中发 酵30-180小时后，再将富产天麻素天麻内生菌按照5-20%的体积比接入共生培养基中于 温度为20-70°C、搅拌转速为10-600转/分钟条件下发酵1-20天；所述共生发酵培养基 为：蔗糖l〇-l〇〇g/L、麸皮浸出汁10_200ml/L、硫胺素0? l-50g/L、乙醇l-50g/L、磷酸二氢 钾0. l-10g/L、基质10-900ml/L ;所述的基质为榛叶汁、榛树疏松愈伤组织浆、榛树内生菌 发酵液、板栗叶汁、栎皮汁中的一种；
[0016] (2)将发酵好的共生发酵液加入1-10%重量比复合酶于40°C -55°c下酶解20-60 小时，将酶解后的共生发酵液浓缩，得到发酵天麻浸膏；所述的复合酶为重量比为1 : 1的 纤维素酶和淀粉酶；
[0017] (3)将发酵天麻浸膏与70%甲醇溶液按照体积比1 : 10-30比例混匀，浸提 30-90min，然后在功率400W温度50-70°C条件下，微波提取10_50min，过滤，浓缩，干燥，得 天麻素。
[0018] 本发明所述采集天麻生长点的菌材是指天麻生长处于其共生的菌材。
[0019] 试验例
[0020] 稳定性试验：取实施例1、实施例3、实施例5的天麻素，制备成注射液，制剂制备工 艺为：取天麻素l〇〇g，加注射用水至lOOOrnl，溶解完全，0. 22 ym滤芯过滤，灌装，121 °C灭菌 15分钟，包装，得到注射液1000支。取每个实施例样品30支，按《药物稳定性指导原则》进 行长期稳定性试验，分别于〇、1、2、3月取样考察样品中天麻素含量及有关物质含量，试验 结果见表1。
[0021] 制剂天麻素含量测定方法：
[0022] 照高效液相色谱法（中国药典2010年版二部附录V D)测定
[0023] 色谱条件与系统适用性试验用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈_0. 1% 磷酸水（3 : 97)为流动相；检测波长为220nm。取天麻素与杂质I各适量，加水溶解并稀 释制成每lml中含天麻素与杂质I分别约为50 y g的溶液，作为系统适用性溶液。取10 y 1 注入液相色谱仪，记录色谱图，理论板数按天麻素峰计算不低于5000,天麻素峰与杂质I峰 的分离度应大于10。
[0024] 测定法精密量取本品适量，用水定量稀释制成每1ml中含50 yg的溶液，摇匀，精 密量取10 y 1注入液相色谱仪，记录色谱图；另取天麻素对照品适量，同法测定。按外标法 以峰面积计算，即得。
[0025] 杂质I :4-(3,4,5_三羟基-6-羟甲基）-四氢-2H-吡喃-2-基氧基苯甲醛， C13H160 7,分子量 284. 36
[0026] 有关物质：取本品适量，加水稀释制成每1ml中含0. 5mg的溶液，作为供试品溶液； 精密量取lml，置100ml量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，作为对照溶液。照含量测定项下的 色谱条件，取对照溶液10 U 1注入液相色谱仪，调节检测灵敏度，使主成分色谱峰的峰高约 为满量程的30% ;再精密量取供试品溶液与对照溶液各10 y 1，分别注入液相色谱仪，记录 色谱图至主成分峰保留时间的3倍。供试品溶液的色谱图中如有杂质峰，单个杂质峰面积 不得大于对照溶液主峰面积的0. 5倍（0,5% )，各杂质峰面积的和不得大于对照溶液主峰 面积（1. 0% )。
[0027] 表1不同实施例天麻素注射液稳定性比较试验结果
【主权项】
1. 一种天麻素的制备方法，其特征在于：该方法为：将富产天麻素天麻内生菌和富产 天麻素蜜环菌菌株接种于共生发酵培养基中发酵，再从发酵产物中提取得到天麻素。
2. 根据权利要求1所述的一种天麻素的制备方法，其中富产天麻素天麻内生菌的制备 方法为： 采集新鲜天麻的块茎、花茎、花或果实，在无菌条件下，用75 %酒精消毒，无菌水冲洗， 吸干多余水分，分别切成〇. 3cm*0. 3cm左右的小段或用无菌研钵磨成浆状，接种在查氏培 养基和PDA培养基上，在20-60°C恒温培养1-10天，获得天麻内生菌的微生物菌株，然后用 筛选培养基发酵实验，采用高效液相色谱定性检测发酵液中天麻素的含量，从中筛选出富 产天麻素天麻内生菌，备用； 所述筛选培养基为：葡萄糖l-50g/L、酵母膏l-10g/L、蛋白胨l-10g/L、硫酸镁 0?l-10g/L、磷酸二氢钾 0?l-5g/L、蜜环菌汁 200-800ml/L。
3. 根据权利要求1所述的一种天麻素的制备方法，其中富产天麻素蜜环菌菌株的制备 方法为： 采集天麻生长点的菌材，将其在无菌条件下，用75%酒精消毒，无菌水冲洗，吸干多余 水分后分别切成〇. 3cm*0. 3cm左右的小段或用无菌研钵磨成浆状，分别接种在查氏培养基 和PDA培养基上，在20-30 °C恒温培养1-10天，长出微生物，用筛选培养基发酵实验，利用高 效液相色谱定性定量检测发酵液中天麻素的含量，从中筛选出富产天麻素蜜环菌菌株，备 用； 所述筛选培养基为：葡萄糖l-50g/L、酵母膏l-10g/L、蛋白胨l-10g/L、硫酸镁 0?l-10g/L、磷酸二氢钾 0?l-5g/L、榛叶汁 200-800ml/L。
4. 根据权利要求1所述的一种天麻素的制备方法，其中天麻素的制备方法为： (1) 将富产天麻素蜜环菌菌株按照5-20%的体积比接种到共生发酵培养基中发酵 30-180小时后，再将富产天麻素天麻内生菌按照5-20%的体积比接入共生培养基中于温 度为20-70°C、搅拌转速为10-600转/分钟条件下发酵1-20天；所述共生发酵培养基为： 蔗糖10-100g/L、麸皮浸出汁10-200ml/L、硫胺素0?l-50g/L、乙醇l-50g/L、磷酸二氢钾 0.l-10g/L、基质10-900ml/L;所述的基质为榛叶汁、榛树疏松愈伤组织浆、榛树内生菌发 酵液、板栗叶汁、栎皮汁中的一种； (2) 将发酵好的共生发酵液加入1-10 %重量比复合酶于40°C-55°C下酶解20-60小 时，将酶解后的共生发酵液浓缩，得到发酵天麻浸膏；所述的复合酶为重量比为I: 1的纤 维素酶和淀粉酶； ⑶将发酵天麻浸膏与70%甲醇溶液按照体积比1 : 10-30比例混勾，浸提30-90min， 然后在功率400W温度50-70°C条件下，微波提取10_50min，过滤，浓缩，干燥，得天麻素。
【专利摘要】本发明属于医药或食品技术领域，具体涉及一种天麻素的制备方法，该方法将富产天麻素天麻内生菌和富产天麻素蜜环菌菌株接种于共生发酵培养基中发酵，再从发酵产物中提取得到天麻素。该方法工艺简单，适合工业化生产，不会造成资源浪费以及环境污染，以本发明制备方法得当的天麻素为原料，制备成注射液具有更好的稳定性。
【IPC分类】C12P19-44, C12R1-645
【公开号】CN104762348
【申请号】CN201510209113
【发明人】冯漾
【申请人】冯漾
【公开日】2015年7月8日
【申请日】2015年4月29日