一种酶法制备低聚木糖的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种酶法制备低聚木糖的方法，属于基因工程技术领域。
【背景技术】
[0002] 低聚木糖是功能性低聚糖的一种，是由2~10个木糖分子以0 -1，4-糖苷键连接 而成的低聚合度糖类，其有效成分为木二糖、木三糖、木四糖、木五糖等，大部分产品以木二 糖和木三糖为主。低聚木糖与大豆低聚糖、低聚果糖、低聚异麦芽糖等相比具有十分显著的 优势，它可以选择性地促进肠道双歧杆菌等有益菌的增殖活性。并且其双歧因子功能是其 他聚合糖类的10-20倍。在自然界中，竹笋、水果、蔬菜等少数天然植物中含有少量的低聚 木糖，另外，一部分植物半纤维素在反刍动物体内也可以被部分分解为低聚木糖。
[0003] 低聚木糖很难被人体消化液如唾液、胃液、胰液等酶液所分解。因此它既不会增加 血糖浓度，也不会影响血糖中胰岛素的水平，同时不会造成脂肪的堆积，故糖尿病人、肥胖 病人和低血糖病人均可放心食用。低聚木糖和其他低聚糖相比有良好的酸稳定性和热稳定 性。即使在pH 2. 5~7. 0的酸性环境及加热到100°C也基本不会分解。低聚木糖的储存性 能很好，在37°C的条件下存放2个月几乎不会被破坏而造成损失，并且粘度较低，操作使用 比较方便。因此低聚木糖被广泛应用于医药保健、乳品饮料、饲料和食品等领域。
[0004] 目前低聚木糖是利用内切木聚糖酶或重组菌产耐热木聚糖酶定向水解来制得，并 得到一般以木二糖、木三糖为主的低聚木糖。内切木聚糖酶能够特异性降解木聚糖中的 0 -1，4-木糖苷键，其主要水解产物为低聚木糖系列，并伴随着产生一些阿拉伯糖和木糖等 单糖，副产物较少，有利于后续工艺中低聚木糖的分离、提纯和精制，所以该法是目前低聚 木糖生产的主要研宄方向。但木聚糖酶还存在一些缺点，如稳定性差、使用效率低、半衰期 短等问题，使酶的生产和使用受到了极大的限制。内切葡聚糖酶在由长链纤维素降解成纤 维低聚糖的过程中发挥着重要的作用，其起作用的位置是纤维素分子内部的非结晶区，随 机水解纤维素分子内的0-1，4-糖苷键，产生短的纤维素链，暴露出新的纤维素末端。并与 外切葡聚糖酶和葡萄糖苷酶协同作用水解纤维素。目前未发现利用外源表达内切葡聚 糖酶催化制备低聚木糖的相关报道。
【发明内容】
[0005] 本发明所要解决的技术问题是，通过基因工程的手段得到一种能够将目的酶（内 切葡聚糖酶EG I )分泌到菌体细胞外的工程酵母菌，并用其分泌的酶液代替内切木聚糖 酶来制备低聚木糖。
[0006] 为解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案如下：
[0007] 一种酶法制备低聚木糖的方法，其特征在于，将内切葡聚糖酶EG I基因在巴斯德 毕赤酵母（Pichia Pastoris)中表达，得到的内切葡聚糖酶EG I用于降解木聚糖制备低 聚木糖。
[0008] 其中，所述的内切葡聚糖酶EG I基因来源于里氏木霉。
[0009] 一种酶法制备低聚木糖的方法，该方法包括如下步骤：
[0010] (1)构建酵母工程菌：
[0011] (la)应用PCR方法获得里氏木霉内切葡聚糖酶EG I基因；
[0012] (lb)将步骤（la)得到的内切葡聚糖酶EG I基因插入pPICZa A质粒中构建重组 质粒 pPICZaA-eg I;
[0013] (lc)将重组质粒pPICZ a A-eg I转化到大肠杆菌中进行扩增，用Pme I线性化 后，电击转化入宿主菌巴斯德毕赤酵母中，得到酵母工程菌，该酵母工程菌已保藏于中国微 生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，登记入册编号为CGMCC NO. 9762,保藏日期为 2014年10月13日，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮编为100101，分类命 名：巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris);
[0014] (2)利用步骤（lc)得到的外源表达内切葡聚糖酶的酵母工程菌CGMCC NO. 9762 诱导表达内切葡聚糖酶EGI;
[0015] (3)将步骤⑵得到的内切葡聚糖酶EGI催化木聚糖解聚为低聚木糖。
[0016] 步骤⑵中，诱导表达内切葡聚糖酶EG I的方法如下：将酵母工程菌CGMCC NO. 9762在BMGY培养基中培养至0D600为2. 0~6. 0,离心弃上清，菌体用BMMY培养基重悬至 0D600为1.0,用甲醇诱导菌体产内切葡聚糖酶EG I。
[0017] 其中，甲醇诱导过程中维持甲醇的浓度为0. 05~0. lml/L，甲醇诱导浓度优选为 0? lml/L〇
[0018] 其中，甲醇诱导的时间为96~120h，优选诱导时间为120h。
[0019] 步骤（3)中，内切葡聚糖酶EG I催化木聚糖解聚为低木聚糖的方法如下：向 10~100ml浓度为0. 05mol/L的柠檬酸缓冲液中加入内切葡聚糖酶EG I与木聚糖，混合 均匀，调节pH值为4. 0~6. 0, pH优选为4. 8;于30~50°C条件下酶解24~72h，酶解温 度优选为50°C，酶解时间优选为36h。
[0020] 其中，内切葡聚糖酶EG I与木聚糖的添加比例为5~50U:lg。
[0021] 有益效果：本发明使用构建重组工程菌的方法，将内切葡聚糖酶EG I通过穿梭 质粒整合到能够外源表达蛋白的毕赤酵母工程菌中，从而获得能够外源表达内切葡聚糖酶 EG I的酵母工程菌，该酵母工程菌经甲醇诱导后表达内切葡聚糖酶EG I，用表达的内切 葡聚糖酶EG I酶液水解木聚糖制备低聚木糖。本发明为低聚木糖的制备提供了一个新方 法。
【附图说明】
[0022] 图1重组质粒pPICZ a A-eg I的结构示意图。
[0023] 图2以桦木为底物的低聚木糖酶解得率及随着酶解时间增长酶解液中低聚木糖 含量的变化趋势图，其实验条件为：〇. 〇2g/L的底物浓度，每g木聚糖酶添加酶40U，反应体 系为50ml。
【具体实施方式】
[0024]根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实 施例所描述的内容仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本 发明。
[0025] 实施例1 :目的基因的获得。
[0026] 根据NCBI上的里氏木霉的EG I基因（M15665. 1)设计引物用于获得内切葡聚糖 酶（EG I )基因（其核苷酸序列如SEQ ID NO :1所示），引物设计软件采用Stratagene公 司的在线引物设计软件QuikChange? Primer Design Program。选用EcoR I和Not I酶 切位点，引物设计如下（下划线为酶切位点）：
[0027] c.boipp.f(SEQ ID NO：2)5,-GAATTCATGGCGCCCTCAGTTACAC-3'
[0028] EcoR I
[0029] c. boitt. r(SEQ ID NO：3)5,-GCGGCCGCTCAACGCTCTAAAGGCAT-3'
[0030] Not I
[0031] 表1PCR反应参数
【主权项】
1. 一种酶法制备低聚木糖的方法，其特征在于，将内切葡聚糖酶EGI基因在巴斯德 毕赤酵母（PichiaPastoris)中表达，得到的内切葡聚糖酶EGI用于降解木聚糖制备低 聚木糖。
2. 根据权利要求1所述的酶法制备低聚木糖的方法，其特征在于，所述的内切葡聚糖 酶EGI基因来源于里氏木霉，其核苷酸序列如SEQIDNO:1所示。
3. 根据权利要求1所述的酶法制备低聚木糖的方法，其特征在于，该方法包括如下步 骤： (1) 构建酵母工程菌： (la) 应用PCR方法获得里氏木霉内切葡聚糖酶EGI基因； (lb) 将步骤（Ia)得到的内切葡聚糖酶EGI基因插入pPICZaA质粒中构建重组质粒 pPICZaA-egI； (lc) 将重组质粒pPICZaA-egI转化到大肠杆菌中进行扩增，用PmeI线性化后，电 击转化入宿主菌巴斯德毕赤酵母中，得到酵母工程菌，该酵母工程菌已保藏于中国微生物 菌种保藏管理委员会普通微生物中心，登记入册编号为CGMCCNO. 9762 ; (2) 利用步骤（Ic)得到的外源表达内切葡聚糖酶的酵母工程菌CGMCCNO. 9762诱导表 达内切葡聚糖酶EGI; (3) 将步骤（2)得到的内切葡聚糖酶EGI催化木聚糖解聚为低聚木糖。
4. 根据权利要求3所述的酶法制备低聚木糖的方法，其特征在于，步骤（2)中，诱导表 达内切葡聚糖酶EGI的方法如下：将酵母工程菌CGMCCNO. 9762在BMGY培养基中培养至 0D600为2.O~6. 0,离心弃上清，菌体用BMMY培养基重悬至0D600为1. 0,用甲醇诱导菌体 产内切葡聚糖酶EGI。
5. 根据权利要求4所述的酶法制备低聚木糖的方法，其特征在于，甲醇诱导过程中维 持甲醇的浓度为〇. 05~0.lml/L。
6. 根据权利要求4所述的酶法制备低聚木糖的方法，其特征在于，甲醇诱导的时间为 96 ~120h。
7. 根据权利要求3所述的酶法制备低聚木糖的方法，其特征在于，步骤（3)中，内切葡 聚糖酶EGI催化木聚糖解聚为低木聚糖的方法如下：向10~100mL浓度为0. 05mol/L的 柠檬酸缓冲液中加入内切葡聚糖酶EGI与木聚糖，混合均匀，调节pH值为4. 0~6. 0,于 30~50°C条件下酶解24~72h。
8. 根据权利要求7所述的酶法制备低聚木糖的方法，其特征在于，内切葡聚糖酶EGI 与木聚糖的添加比例为5~50U:lg。
【专利摘要】本发明公开了一种酶法制备低聚木糖的方法，将内切葡聚糖酶EGⅠ基因在巴斯德毕赤酵母(Pichia Pastoris)中表达，得到的内切葡聚糖酶EGⅠ用于降解木聚糖制备低聚木糖。本发明构建的酵母基因工程菌已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，登记入册编号为CGMCC NO.9762，保藏日期为2014年10月13日。利用该酵母基因工程菌表达得到的内切葡聚糖酶EGⅠ酶解木聚糖，酶解36小时，低聚木糖得率达到68.12％。CGMCC NO.976220141013
【IPC分类】C12N15-81, C12N15-56, C12P19-14, C12R1-84, C12N9-42
【公开号】CN104762343
【申请号】CN201510142708
【发明人】勇强, 尹利旻, 杨磊, 李鑫, 赖晨欢, 徐勇, 欧阳嘉, 余世袁
【申请人】南京林业大学
【公开日】2015年7月8日
【申请日】2015年3月27日