用于核酸扩增的链霉亲和素修饰聚苯乙烯微球的制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于基因组测序领域，具体涉及一种应用于基因组测序核酸扩增的羧基化 聚苯乙烯微球的制备方法。
【背景技术】
[0002] 作为上世纪生命科学领域最重要的发明之一，DNA测序技术深刻地改变了人们对 生命本质的理解和掌控能力，极大地推动了全球生命科学领域研宄的发展。假如没有测序 技术，基因序列就无法确定，酶切、克隆、反转录、cDNA、PCR、SNP、RNAi等研宄技术也就根本 无从谈起，生命科学领域不会有今日的蓬勃发展。生命科学领域无人不晓的GenBank，以及 历时13年耗资3亿美元的全球合作完成的人类基因组计划，无不建立在测序的基础上。
[0003] 自1977年Sanger发明了利用了 DNA聚合酶的双脱氧终止原理测定核苷酸序列的 技术以来，测序技术不断改进，新方法相继问世，测序规模也不断扩大。测序技术的操作简 单化、成本低廉化、以及高通量化成为测序技术的发展方向。SOLiD，454以及Solexa等为代 表的新一代高通量测序技术，以三国鼎立的姿态平分着序列测定的天下。三种技术各有千 秋，发展更新的速度可谓日新月异。但目前而言，其测序文库制备的过程均仍较为复杂。
[0004] 测序文库的制备作为整个测序过程中的第一个且及其重要的一个步骤，对测序结 果的优劣有着决定性的作用。测序文库的制备大体来说包括以下几个步骤。第一步是如何 将核酸从待检测的样本中高质量地提取出来。针对不同的样本，人们所选用的实验流程和 方式将会有较大的差异；第二步是如何将长片段的核酸进行小片段花处理，主要针对基因 组DNA及长片段的RNA等样本，因为目前测序仪对于读长的限制，只能对制备的随机小片段 进行测序，再通过生物信息学方法进行拼接，得出全基因组的序列信息。目前核酸小片段化 基本使用物理作用来进行，超声波由于其自身的各种优点而成为打碎DNA的普遍方式，可 通过调节超声功率及超声时间来获得不同长度的小片段DNA。第三步便是如何将小片段核 酸的两端连接上测序所需的通用接头序列；第四步是如何将连接有接头序列的核酸序列进 行单分子多拷贝扩增，包括有乳液PCR、桥式PCR及滚环扩增等，在扩大测序信号强度的同 时确保真实的反映样本的原始信息。而乳液PCR -般采用微球捕获一个模板DNA到一个小 球，利用乳液PCR扩增单一模板，将同一模板在一个微球上扩增成上百万个模板克隆。
[0005] -般来讲，在乳液PCR中采用的微球为聚苯乙烯（PS)微球，并且在微球表面进行 链霉亲和素修饰，从而使其可以捕获生物素标记的DNA分子。目前，合成单分散PS微球的 方法有微乳液聚合法、乳液聚合法、分散聚合法、悬浮聚合法和种子聚合法等。但现有的 合成方法都是交联剂和单体混合后再进行聚合，这种办法合成的聚合物微球聚合物是整 体交联的，往往球形度差，粒径可控性低，因而通常需要分选才能达到粒径分布偏差小于 5%的要求。为了合成得到交联的微球，却又不影响到微球的球形度和单分散性，日本专利 JP58-106554和JP63-191818虽然提出了种子聚合的方法，即先通过乳液聚合获得种子，然 后进行增长，扩大粒子。本方法的缺点是微球在生长过程中，产生次级粒子，需要筛分除去， 造成产品收率降低，操作复杂，经济性差。因此，要得到粒径均一的微米级单分散具有交联 的聚合物微球粒子是非常困难的。
[0006] 由于用于核酸扩增的PS微球需要表面羧基化后才能和链霉亲和素交联，从而与 标记有生物素的DNA模板连接，进而进行乳液PCR扩增。因此，制备羧基含量高的PS微球 是至关重要的，目前，用聚合法制备羧基化聚苯乙烯微球时，均采用添加丙烯酸的方式向聚 苯乙烯微球表面引入羧基。但采用这种方法制备出的羧基化聚苯乙烯微球大部分羧基被包 埋在微球内部，聚苯乙烯微球表面的羧基分布比例不高，一般为0. 25mmol/g。
【发明内容】
[0007] 本发明的一个目的是提供一种链霉亲和素修饰的聚苯乙烯微球的制备方法，其制 备的微球可用于基因组测序文库制备中的核酸扩增，所述微球粒径为25微米，具体步骤如 下：
[0008] (1)将分散剂加入反应介质中，通入氮气；搅拌至均相体系；
[0009] (2)将苯乙烯单体和引发剂加入反应体系中；将反应体系升温；然后在搅拌条件 下进行恒温反应；冷却至室温、洗涤、干燥，即得聚苯乙烯微球；
[0010] (3)取另一容器病加入邻苯二甲酸酐（PA)粉末及一定量的溶剂，超声振荡lOmin， 然后加入聚苯乙烯微球，向反应瓶中通纯氮一段时间后，在搅拌状态下加入三氯化铝，再通 纯氮3min后60°C下反应6小时，即得羧基化聚苯乙烯微球。
[0011] (4)取羧基化聚苯乙烯微球，加入乙磺酸缓冲液（MES)混合均匀后加入水溶性碳 二亚胺类交联剂（EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺（NHS)活化，EDC浓度1. 0-1. 5g/L，EDC与NHS 比例1:1之间，室温条件下温和搅拌，时间控制在20min ;离心洗绦，去上清，沉淀经0.1mol/ LPBS重悬、振荡、超声处理后即得到活化的聚苯乙烯微球；取链霉亲和素溶于pH6. 7的PBS 缓冲液中，加入到经过活化的聚苯乙烯微球溶液中，室温条件下温和搅拌，反应时间3h ; 13000g离心20min，沉淀用含有0. 05% Tween20的PBS重复洗涤后的微球经超声分散重悬 于PBS缓冲液中，加入赖氨酸，室温轻微震荡30min，离心洗涤，即得。
[0012] 在本发明的一个实施方案中，所述反应介质选自水、乙醇、乙二醇单甲醚和甲醇的 一种或者两种以上的任意组合。在优选的实施方案中，所述反应介质为水和乙二醇单甲醚， 其中，水和乙二醇单甲醚的重量百分比为10~90%和10~90% ;也可以为20~40%和 60~80%，优选为23%和77%。
[0013] 所述的分散剂为磷酸钠、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙二醇、聚丙烯酸、聚乙烯醇和羟丙 基纤维素中的一种或者两种以上的任意组合。在优选的实施方案中，所述分散剂由聚乙 烯醇、羟丙基纤维素和聚乙二醇组成，聚乙烯醇、羟丙基纤维素和聚乙二醇的重量百分比为 10~80%、10~80%和10~80% ;也可以为20~40%、30~50%和20~50%，优选为 25%、35%和 40%。
[0014] 引发剂选自偶氮二异丁腈（AIBN)或者过氧化苯甲酰（BPO)的一种或两种的任意 比例组合。在优选的实施方案中，所述引发剂为偶氮二异丁腈。
[0015] 在本发明另一个实施方案中，在最终的反应体系中，苯乙烯单体、分散剂、引发剂 和反应介质的重量百分比依次为5~40%的苯乙烯单体，0. 1~1%的分散剂，0.025~ 0. 125%的引发剂，反应介质余量；优选为32%的苯乙烯单体，0. 3%的分散剂，0. 05%的引 发剂，反应介质余量。
[0016] 在本发明进一步地实施方案中，所述步骤（2)将反应体系升温至10-90°c，优选为 75°C ;搅拌速度控制在80~120转/分钟，优选为100转/分钟。
[0017] 在本发明的另一个实施方案中，在步骤（3)中，所述溶剂由硝基苯和二氯甲烷组 成，硝基苯和二氯甲烷的体积比为1:7 ;聚苯乙烯微球、邻苯二甲酸酐和三氯化铝的重量比 为 1 :0· 02 :0· 05。
[0018] 在本发明优选的实施方案中，在步骤（4)中，所述离心洗涤的条件为转速13000g 离心20min，用0. lmol/L磷酸缓冲液（PBS)重复清洗沉淀三遍；所述羧基化聚苯乙烯微球 与链霉亲和素的重量比为1:0. 5。
[0019] 在基因组测序中，用于DNA文库中核酸扩增的PS微球的粒径一般为25微米，并且 要求单分散性好。但在PS微球制备方法中，分散聚合法制备的PS微球单分散性好，但微 球的粒径较小，种子聚合法和悬浮聚合法虽然制备的PS微球粒径较大，但微球的单分散性 差，分散系数高。因此在本领域中，制备粒径为20至50微米的单分散PS微球一直存在着 上述问题。本发明通过大量试验摸索并且意外发现，在一种特定的反应条件下，采用分散聚 合法成功制备出单分散PS微球，粒径为25微米并且分散系数低。另外，由于PS微球用于 乳液PCR扩增时需要进行链霉亲和素修饰，而PS微球需要进行表面羧基化后才能和链霉亲 和素交联，因此，本发明对PS微球的表面羧基化和链霉亲和素修饰的反应条件进行了系统 性优化，从而得到了一种链霉亲和素引入量较高的聚苯乙烯微球。
【具体实施方式】
[0020] 下面将进一步的举例说明本发明。需要指出的是，以下说明仅仅是对本发明要求 保护的技术方案的举例说明，并非对这些技术方案的任何限制。本发明的保护范围以所附 权利要求书记载的内容为准。
[0021] 实施例1聚苯乙烯微球的制备
[0022] 向反应容器中加入230g的水、770g的乙二醇单甲醚、I. Ig的聚乙烯醇、I. 54g的羟 丙基纤维素和I. 76g的聚乙二醇，通入氮气保护，并在室温下搅拌20分钟至均相体系，然后 加入苯乙烯单体473g和偶氮二异丁腈0. 73g。升温至75°C，恒温反应8小时。反应结束， 冷却至室温，产品离心，并用乙醇反复洗涤，干燥，即得单分散PS微球。
[0023] 实施例2聚苯乙烯微球的制备
[0024] 向反应容器中加入230g的水、770g的乙二醇单甲醚、1.0 g的聚乙烯醇、I. 59g的羟 丙基纤维素和1.81g的聚乙二醇，通入氮气保护，并在室温下搅拌20分钟至均相体系，然后 加入苯乙稀单