的测序采用 ABI BigDye3. I测序试剂盒（Applied Biosystems)和 DNA 自动测序仪（model ABI3730; Applied Biosystems)。
[0040] 测序结果表明，菌株YS17 (CGMCC No. 9738) 16S rRNA基因序列长度为1512 bp。 其16S rRNA基因的核苷酸序列如序列表1所示。
[0041] 将测序结果在GenBank及EzTaxon数据库中进行同源比对分析，其序列与 Aeromicrobium erythreum 16S rRNA 96. 8%〇
[0042] 如上所述的 16S rRNA 序列使用软件 MEGA version6. 0· software package 绘制进化关系树。采用neighbor-joining计算，并以maximum-parsimony和 maximum-likelihood进行验证计算，bootstrap设置为1000个循环。结果如图1所示。从 图1可见，通过对16S rRNA基因的系统发育树分析，菌株YS17可以归入到气微菌属。与 ^M^^H^Aeromicrobium erythreum),HH^H^Aeromicrobium alkaliterrae)为W 参田气微菌（为 96. 8%，96. 7% 和 96. 7%。而 97% 则是同一 属内不同种类菌株相似性的16S rNA的阈值，而且很多文献中证明了有些菌16S rRNA基因 序列的相似性超过了 99%，但是他们仍然属于不同的菌种。故菌株BD3526较有可能为新的 微生物物种，有待其他生理生化指标的验证。
[0043] 实施例6:本发明新微生物的脂肪酸含量特征 菌株YS17的总脂肪酸含量的测定。
[0044] 配置如下溶液：I，45g氢氧化钠溶于150ml甲醇及150ml蒸馏水；II，190ml浓 盐酸，275ml甲醇溶于135ml蒸馏水；III，200ml正己烷与200ml乙醚混合均匀；IV，10. 8 克氢氧化钠溶于900ml蒸馏水；V，饱和氯化钠溶液。
[0045] 1)取适量细菌培养物，置于8ml螺口玻璃管中，加入1ml溶液1，拧紧螺盖，沸水浴 5min，取出振荡5-10秒，再度拧紧螺盖，继续沸水浴25min ; 2) 待样品管冷却后，加入2ml溶液II，盖严振荡，随后精确控制80 ±1°C水浴IOminjK 浴冷却；此步骤需严格控制温度和时间，以免羟基酸和环式脂肪酸受到破坏； 3) 在冷却的样品管中加入I. 25ml溶液III，快速振荡IOmin左右，弃去下层水相； 4) 在剩余有机相中加入3ml溶液Γν及几滴溶液V，快速振荡5min左右，取三分之二上 层有机相置气相色谱样品瓶中备用。
[0046] HP 6890气相色谱仪，配备分流/不分流进样口，氢火焰离子化检测器（FID)及HP 气相色谱化学工作站（HP CHEMSTATION ver A 5. 01);色谱柱为Ultra-2柱，长25m，内径 0. 2mm，液膜厚度0. 33mm ;炉温为二阶程序升温：起始温度170°C，每min5°C升至260°C，随 后以40°C/ min升至310°C，维持1.5min;进样口温度250°C，载气为氢气，流速0. 5ml/ min，分流进样模式，分流比100:1，进样量2ml ;检测器温度300°C，氢气流速30ml/min，空气 流速216ml/min，补充气(氮气）流速30ml/min。
[0047] 结果显示，菌株YS17的主要细胞脂肪酸为不饱和脂肪酸C18:1?9c、结核硬脂酸 10-Methyl C18:Q和十六碳饱和脂肪酸C16 :0,百分含量分别为16. 24%、30. 17%、18. 5%。符 合气微菌属主要的脂肪酸类型。而且同相似菌株脂肪酸种类与含量上，均有差异，以此判断 同相似菌株属于不同种类。
[0048] 实施例7:本发明新微生物的G + C mol%含量特征 菌株YS17基因组DNA的G+C mol%含量测定。
[0049] 使用熔解温度（Tm)法，以大肠埃希氏（凡co/i K12,ASL 365)为参比对照，所用仪 器为 Agilent Technologies 公司 Cary Series UV-Vis Spectrophotometer，用 PTP-1 数字 温度控制仪控温。步骤如下： 1) 将待测DNA样品用0.1 X SSC稀释至0D26Qnm值于0. 3 ~ 0. 4之间； 2) 在波长260nm首先记录25° C的OD值，然后设定升温程序，从30°C开始到95° C， 其间每分钟升尚1°C ; 3) OD值上升表示变性开始，记录比色皿温度和OD值，直至OD值不变表示变性完毕； 4) 根据热变性曲线，得出熔链温度（Tm)，计算G+C mol%含量。
[0050] 在0· I X SSC溶液中计算公式为： G+Cmol%=G+Cmol%(AS1.365)+ 2.08(Tm#ft-TmAsl 365) 试验测定的凡co/i K12 AS1 365的Tm为75. 97° C和51. 6 mol%，待测菌株YS17的Tm 值和 G+Cmol% 分别为 83. 02 和 66. 3 mol%。
[0051] 实施例8:本发明新微生物的DNA-DNA杂交试验 菌株YS17同遗传亲缘关系最相似的菌种及类芽孢杆菌属模式菌种的杂交试验。
[0052] 参考16S rRNA的结果，对YS17与遗传亲缘关系最相似的种 erythreum DSM 8599T, Aeromicrobium alkaliterrae JCM 13518τ矛口 Aeromicrobium JCM 14732τ 进行 DNA-DNA 杂交试验。
[0053] 采用液相复性率方法，所用仪器为Cary Series UV-Vi Spectrophotometer。温度 控制用 Peltier temperature-controlling programmer 数字控温程序。步骤如下： DDNA样品处理：如上所述实施例5中提取的DNA样品，实验前需先置冰浴中用超声 波40W打24分钟（设定为：打3秒/停3秒；DNA样品浓度为0D260nm 2. 0,将DNA样品剪切 2~5 X IO5道尔顿的片段。
[0054] 2)将待测DNA样品（A、B)分别用0.1 XSSC精确配制成为0D260nml. 8~ 2. 0,且 两者0D260nm值一致； 3)进入Kinetics程序，出现其方法窗口，在方法窗口中设置合适的测定参数。测定 波长为260nm，总测定时间设定为30分钟。按照已经测定的G+C mol%计算最适复性温度 (optimal renaturation temperature，T0R)，将比色杯的温度稳定在最适复性温度。在 2父53(：反应液中，最适复性温度按公式：1'(?=0.51\(6+〇111〇1%+47计算。
[0055] 4)取两株菌种DNA样品各720 μ 1分别装在两个离心管中，再取两株菌种DNA样 品各360 μ 1装在同一个离心管中为混合样品； 5)单一 DNA样品和混合DNA样品测试前分别通过空气浴（Themomixer, Eppendorf生 产)100°C变性lOmin，然后迅速转移到预热的比色皿中，降温至最适复性温度。记录0D260nm 值，待反应进行到30min时，停止读数，全部过程样品的温度都不得低于T0R，最终得到一条 随时间延长，光吸收值逐渐减小的直线； 5)以时间为横坐标，0D260nm为纵坐标，绘制复性曲线，该线的斜率即为DNA的复性速 率（VM ;VA ;VB)。
[0056] DNA同源性计算：依据De Ley等的公式计算 H% = (4VM-VA-VB) / 2 (VAX VB) 1/2 X100% DNA-DNA杂交的结果如下： IMlttYS 17 Aeromicrobium erythreum DSM 8599T> Aeromicrobium alkaliterrae 兀皿135181和^^〇?化，〇/^油？^//?此/7^/>5〇以兀厘14732 1的0嫩相关性分别为10.9%， 16. 8%和10. 9%，均大大低于国际系统细菌学委员会（International Committee on Systematic Bacteriology, ICSB)在1987年关于DNA相关性70%为细菌种的界限规定。 结合实例2,3,4,5,6的数据，由此判定，菌株YS17为属的一个新菌种，该菌 株的分类地位是5/Z，依照国际细菌系统分类委员会的命名方法，欲将该种 命名为caffieBiae sp.nov.，并选菌株YS17为该种的模式菌株。
[0057] 实施例9:本发明新微生物的用途 经API ZYM鉴定系统(生产厂商：bioMe' rieux)测定，菌株YS17具有酯酶（C4)，类脂 酯酶（C8)及胰凝乳蛋白酶活性。
[0058] 作为微生物来源的酯酶和蛋白酶在食品、医药和化工等行业具有有广泛应用。
【主权项】
1. 一种气微菌，该菌株的保藏号为CGMCC No. 9738。
2. -种根据权利要求1所述的气微菌的培养方法，其特征在于该方法是将气微菌YS17 CGMCC No. 9738接种于培养基中，在15-50°C，pH5. 5-12. 0的条件下进行培养。
3. 根据权利2所述的方法，其特征在于：所述最适培养温度为30-37°C。
4. 根据权利2所述的方法，其特征在于：所述最适pH为7. 0-8. 0。
5. 如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的培养的培养基中还包括质量百分比 浓度不超过11%的NaCl。
6. 如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的培养在需氧条件下进行。
7. -种根据权利要求1所述的气微菌在液体发酵生产蛋白酶和酯酶中的应用。
【专利摘要】本发明涉及一种气微菌及其应用。本发明所提供的气微菌（Aeromicrobium sp.）分离自陈熟普洱茶，保藏号为CGMCC No.9738。依据多相分类学方法，该菌株是气微菌属的一个新种，其分类地位是Aeromicrobium sp.，依据国际细菌系统分类委员会的命名方法，将该种命名为Aeromicrobium camelliae sp.nov.。本发明所提供的气微菌新菌种中温生长（30-37℃），易培养。该新种的发现和利用丰富了我们的可利用微生物资源。本发明所提供的气微菌新菌种具有蛋白酶和酯酶活性，为蛋白酶和酯酶在食品、医药和化工等行业应用提供菌种资源。CGMCC No.973820140926
【IPC分类】C12N1-20, C12N9-16, C12R1-01, C12N9-52
【公开号】CN104805042
【申请号】CN201510188031
【发明人】牛莉莉, 唐天羿, 熊梦洁, 陈婷婷, 陈佳娴, 董文凯
【申请人】上海大学
【公开日】2015年7月29日
【申请日】2015年4月21日