可变区的基因、以及可与该基因功能性连接的启动子。作为用于在细菌中表达编码本发 明的抗体的基因或编码其重链可变区的基因和/或编码轻链可变区的基因的启动子，在宿 主为埃希氏菌属细菌的情况下，可以列举例如Trp启动子、lac启动子、recA启动子、入PL 启动子、lpp启动子、tac启动子等。作为酵母中的表达用启动子，可以列举例如PH05启动 子、PGK启动子、GAP启动子、ADH启动子，作为芽孢杆菌属细菌中的表达用启动子，可以列举 SL01启动子、SP02启动子、penP启动子等。另外，在宿主为哺乳动物细胞等真核细胞的情 况下，可以列举SV40来源的启动子、逆转录病毒的启动子、热激启动子等。
[0114] 使用细菌、特别是大肠杆菌作为宿主细胞的情况下，本发明的表达载体可以进一 步含有起始密码子、终止密码子、终止子区和可复制单元。另一方面，使用酵母、动物细胞或 昆虫细胞作为宿主的情况下，本发明的表达载体可以含有起始密码子、终止密码子。另外， 这种情况下，可以含有增强子序列、编码本发明的抗体或其重链可变区或轻链可变区的基 因的5'侧和3'侧的非翻译区、分泌信号序列、剪接位点、多聚腺苷酸化位点或可复制单元 等。另外，可以根据目的含有通常使用的选择标记（例如，四环素耐性基因、氨苄青霉素耐 性基因、卡那霉素耐性基因、新霉素耐性基因、二氢叶酸还原酶基因）。
[0115] 本发明还提供导入有编码本发明的抗体的基因或编码本发明的抗体的重链可变 区的基因和/或编码本发明的抗体的轻链可变区的基因的转化体。这样的转化体例如可以 通过用本发明的表达载体转化宿主细胞来制作。作为转化体的制作中使用的宿主细胞，只 要是适合前述的表达载体且能够进行转化的宿主细胞则没有特别限定，可以例示本发明的
技术领域中通常使用的天然细胞或人工建立的细胞等各种细胞（例如，细菌（埃希氏菌属 细菌、芽孢杆菌属细菌）、酵母（酵母菌属、毕赤酵母菌属等）、动物细胞或昆虫细胞（例如， Sf9)等）。转化可以通过本身公知的方法进行。
[0116] 优选的是，本发明的转化体为使用含有包含编码本发明的抗体的重链可变区的序 列的多核苷酸和包含编码本发明的抗体的轻链可变区的序列的多核苷酸的表达载体转化 后的宿主细胞，或者为使用含有包含编码本发明的抗体的重链可变区的序列的多核苷酸的 表达载体和含有包含编码本发明的抗体的轻链可变区的序列的多核苷酸的表达载体转化 后的宿主细胞。更优选的是，本发明的转化体为使用含有包含编码前述本发明的抗体的重 链的序列的多核苷酸和包含编码本发明的抗体的轻链的序列的多核苷酸的表达载体转化 后的宿主细胞，或者为使用含有包含编码前述本发明的抗体的重链的序列的多核苷酸的表 达载体和含有包含编码本发明的抗体的轻链的序列的多核苷酸的表达载体转化后的宿主 细胞。
[0117] 本发明还提供本发明的抗人IL-23R抗体的生产方法，包括使编码本发明的抗体 的基因或编码本发明的抗体的重链可变区的基因和/或编码本发明的抗体的轻链可变区 的基因在宿主细胞中表达的步骤、即包括使用上述转化体的步骤。优选的是，该方法中使用 的宿主细胞为使用前述本发明的表达载体转化后的宿主细胞，该表达载体可以分别含有或 者同时含有包含编码本发明的抗体的重链可变区的序列的多核苷酸和包含编码本发明的 抗体的轻链可变区的序列的多核苷酸。
[0118] 本发明的抗人IL-23R抗体的生产中，转化体可以在营养培养基中培养。营养培养 基优选含有转化体的生长所需的碳源、无机氮源或有机氮源。作为碳源，可以例示例如葡萄 糖、葡聚糖、可溶性淀粉、蔗糖等，作为无机氮源或有机氮源，可以例示例如铵盐类、硝酸盐 类、氨基酸、玉米浆、蛋白胨、酪蛋白、肉膏、大豆柏、马铃薯提取液等。另外，也可以根据需 要含有其他营养素（例如，无机盐（例如，氯化钙、磷酸二氢钠、氯化镁）、维生素类、抗生素 (例如，四环素、新霉素、氨苄青霉素、卡那霉素等）等）。
[0119] 转化体的培养通过本身公知的方法进行。培养条例如温度、培养基的pH 和培养時间可适当选择。例如，在宿主为动物细胞的情况下，作为培养基，可以使 用含有约5~20 %的胎牛血清的MEM培养基（Science,Vol. 122,p. 501，1952)、 DMEM培养基（Virology,Vol. 8,p. 396, 1959)、RPMI1640 培养基（丄六111.]\^(1. Assoc.，Vol. 199,p. 519, 1967)、199 培养基（proc.Soc.Exp.Biol.Med.，Vol. 73,p. 1，1950) 等。培养基的pH优选为约6~8,培养通常在约30~40°C下进行约15~72小时，也可 以根据需要进行通气、搅拌。在宿主为昆虫细胞的情况下，可以列举例如含有胎牛血清的 Grace's培养基（Proc.Natl.Acad.Sci.USA,Vol. 82,p. 8404, 1985)等，其pH优选为约 5 ~ 8。培养通常在约20~40°C下进行15~100小时，也可以根据需要进行通气、搅拌。在宿 主为细菌、放线菌、酵母、丝状真菌的情况下，例如含有上述营养源的液体培养基是适当的。 优选pH为5~8的培养基。在宿主为大肠杆菌的情况下，作为优选的培养基，可以例示LB 培养基、M9培养基（Miller等、Exp.Mol.Genet,冷泉港实验室，p. 431，1972)等。该情况 下，培养通常可以在14~43°C下进行约3~24小时，根据需要同时可进行通气、搅拌。在 宿主为芽孢杆菌属细菌的情况下，通常可在30~40°C下进行约16~96小时，根据需要可 同时进行通气、搅拌。在宿主为酵母的情况下，作为培养基，可以列举例如Burkholder基本 培养基（Bostian,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,Vol. 77,p. 4505, 1980)，pH优选为 5 ~8。培 养通常在约20~35°C下进行约14~144小时，也可以根据需要进行通气、搅拌。
[0120] 本发明的抗人IL-23R抗体可以通过对如上所述的转化体进行培养而从该转化体 中回收，优选进行分离、纯化。作为分离、纯化方法，可以列举例如盐析、溶剂沉淀法等利用 溶解度的方法、透析、超滤、凝胶过滤、十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳等利用分子 量差异的方法、离子交换层析、羟基磷灰石层析等利用带电的方法、亲和层析等利用特异的 亲和性的方法、反相高效液相色谱等利用疏水性差异的方法、等电聚焦等利用等电点差异 的方法等。
[0121] 以上对本发明进行了全面记载，在此提供用于深化理解而参照的特定实施例，但 这些实施例的目的在于例示，并不限定本发明。
[0122] 实施例
[0123] 关于使用市售的试剂盒或试剂等的部分，只要没有特别说明，则依照随附的操作 规程进行实验。
[0124](实施例1 :人和猴IL-23R-小鼠Fc融合蛋白的获取）
[0125] 为了作为用于制作抗IL-23R抗体的抗原和筛选系统材料使用，本发明人制作了 人IL-23R序列的细胞外部分序列（非专利文献1、序列号1的第24位至第353位氨基 酸）与小鼠免疫球蛋白Fc段的融合蛋白。具体而言，通过PCR法使用引物ED14-1(序列 号2)和ED14-2(序列号3)扩增人IL-23R的细胞外部分序列，将其插入到小鼠Fc融合 蛋白表达用载体pFUSE-mIgG2A_Fc2 (InvivoGen公司）的EcoRI和Bglll位点，制成小 鼠Fc融合IL-23R表达载体。在此，通过PCR法扩增得到的基因内存在引物ED14-1序列 内和人IL-23R基因序列内的两处EcoRI位点，通过部分酶切和琼脂糖凝胶切出得到人 IL-23R基因序列内的EcoRI位点未被切断的基因片段，将其插入该表达载体中。使用基因 导入试剂293fectin(Invitrogen公司）将制作好的载体基因导入到FreeStyle293细胞 (Invitrogen公司）中，将该细胞在使用FreeStyle293表达培养基（Invitrogen公司）的 无血清培养体系中培养后，获取含有人IL-23R-小鼠Fc融合蛋白的培养上清。使用HiTrapA 柱（GEHealthcareJapan公司）和蛋白纯化装置AKTA系统（GEHealthcareJapan公司） 从获取的培养上清中纯化出蛋白质，用于以下的实验。对于猴IL-23R-小鼠Fc融合蛋白， 也使用同样的方法来获取。
[0126](实施例2 :人IL-23R表达293细胞的获取）
[0127] 为了作为用于抗IL-23R抗体的结合性试验和抗体获取的细胞抗原使用，本发明 人获取了全长人IL-23R表达细胞。通过PCR法使用引物AA26-Fw(序列号60)和引物 AA10-4(序列号61)扩增人IL-23R基因全长（非专利文献1、序列号1的全长），将该基因 片段插入克隆载体PCR2.1-T0P0载体（Invitrogen公司）中。确认序列后，将该基因片段 重组到哺乳类细胞表达用载体pcDNA3. 1载体（Invitrogen公司）中。使用Lipofectamine 2000 (Invitrogen公司）将该载体基因导入到人建立培养细胞293细胞中。将该细胞用含 有G418的RPMI1640培养基进行选择培养后，利用有限稀释法进行单克隆化。然后，通过利 用使用荧光色素标记的抗人IL-23R抗体（R&Dsystem公司）的流式细胞术测定筛选出显 示高蛋白表达的克隆来获取人IL-23R表达细胞。
[0128](实施例3 :抗IL-23R抗体产生杂交瘤的制作）
[0129] 为了获取抗人IL-23R抗体，本发明人将实施例1和2中分别获取的人IL-23R-FC 融合蛋白或人IL-23R表达细胞与激起免疫反应的佐剂一起对Veloclmmune小鼠进行免疫。 对小鼠进行数次免疫，确认血中抗体效价的升高，进行最终免疫。依照常规方法摘除免疫后 的小鼠的脾脏、淋巴结等来收集淋巴细胞，将其与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0进行细胞融合，由 此制作杂交瘤。制作杂交瘤的有限稀释样品，进行单克隆化。对各克隆进行扩大培养后，将 培养基变更成作为无血清培养基的CD杂交瘤培养基（Invitrogen公司），培养约5天。使 用蛋白G离心柱（Pro-Chem公司）从所得到的培养上清中纯化抗体。
[0130](实施例4 :ELISA分析）
[0131] 为了测定抗体的抗原特异结合活性，本发明人使用了抗原ELISA。将人或猴 IL_23R_Fc融合蛋白以500ng/mL的浓度固相化到NuncMaxisorp白色384孔板（Maxisorp 384plate;Nunc公司）上。添加封闭剂（BlockingOne;NacalaiTesque公司）并在室温 下静置1小时后，用洗涤液（TPBS;含有0. 05%Tween-20的磷酸缓冲生理盐水（PBS))洗涤 2次，制作纯化抗体样品的适当稀释系列并进行添加。在室温下孵育1小时后，用TPBS洗涤 4次，添加用稀释液稀释至2000倍的辣根过氧化物酶标记的兔抗小鼠Ig抗体（HRP-rabbit anti-mouseIgantibody;DAK0公司）。在室温下孵育1小时后，用洗绦液洗绦4次。加 入化学发光检测试剂BM-ChemiluminescenceELISAsubstrate(POD)(RocheDiagnostics 公司），使用EnVision计数仪（PerkinElmer公司）测定其化学发光量。以复孔对各抗体 进行试验，通过曲线拟合分析EC50。本试验中，作为比较抗体，使用将公知的人源化抗人 IL-23R抗体hum20D7(专利文献1)的