在线工业鲁棒化调控细胞状态生产抗egfr单抗的装置与方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种生物工程领域中可在线调节和控制细胞状态生物反应器生产重组抗EGFR单克隆抗体的过程,尤其涉及一种可在线工业鲁棒化(industrially robust)连续监控连续灌注生物反应器及培养瓶/袋系统的细胞培养环境中各项理、生、化指标，并可直接在线调节和控制细胞状态的细胞培养、扩增和制备重组抗EGFR单克隆抗体的装置和方法，以维持重组抗EGFR单克隆抗体的高质、高效生产。
【背景技术】
[0002]表皮生长因子受体(EGFR)是一个170kDa的跨膜糖蛋白受体酪氨酸激酶，由表皮生长因子激活，影响细胞的生长和分化。EGF或TGFa对EGFR的结合激活受体的酪氨酸激酶活力。EGFR羧基末端的酪氨酸残基Tyrl068、Tyrl 148、和Tyrl 173是EGF结合后发生的自动磷酸化的主要位点。一旦被激活，EGFR1068位和1173位磷酸化的酪氨酸残基就能介导Grb2对EGFR的结合。此外，1173位磷酸化的酪氨酸残基是SHC在EGFR上的主要结合位点。EGFR广泛分布在许多正常和恶性上皮细胞中，其过度表达和自我激活可能与许多肿瘤的发生发展有关。目前主要用于各种上皮源性恶性肿瘤包括头颈部鳞癌、肺癌、乳腺癌和膀胱癌等的研究。
[0003]表皮生长因子与其受体一表皮生长因子受体结合后可引发一系列细胞内变化，最终使细胞发生分化或增殖。表皮生长因子受体是一种受体酪氨酸蛋白激酶，而受体酪氨酸蛋白激酶一Ras — MAPK级联途径是表皮生长因子刺激信号传递到细胞核内的最主要途径。它由以下成员组成:表皮生长因子受体一含有SH2结构域的接头蛋白(如Grb2)—鸟嘌呤核苷酸释放因子(如S0S) — Ras蛋白一MAPKKK(如Rafl) — MAPKK — MAPK —转录因子等。
[0004]表皮生长因子与受体结合后，可以使受体发生二聚体化，从而改变了受体的构象，使其中的蛋白酪氨酸激酶活性增强，受体自身的酪氨酸残基发生磷酸化，磷酸化的受体便形成了与含SH2结构域的蛋白分子Grb2结合的位点，导致Grb2与受体的结合。Grb2中有两个SH3结构域，该部位与一种称为SOS的鸟苷酸交换因子结合，使之活性改变，SOS则进一步活化Ras，激活的Ras作用于MAPK激活系统，导致ERK的激活。最后ERK转移到细胞核内，导致某些转录因子的活性改变从而改变基因的表达状态及细胞的增殖与分化过程。
[0005]EGFR是原癌基因c-erbBl的表达产物，是表皮生长因子受体(HER)家族成员之一。该家族包括 HERl (erbBl，EGFR)、HER2 (erbB2，NEU)、HER3 (erbB3)及 HER4 (erbB4)。
[0006]EGFR广泛分布于哺乳动物上皮细胞、成纤维细胞、胶质细胞、角质细胞等细胞表面，EGFR信号通路对细胞的生长、增殖和分化等生理过程发挥重要的作用。EGFR等蛋白酪氨酸激酶功能缺失或其相关信号通路中关键因子的活性或细胞定位异常，均会引起肿瘤、糖尿病、免疫缺陷及心血管疾病的发生。
[0007]结直肠癌H治疗药Vectibix (抗EGFR单克隆抗体、帕尼单抗)是第一个完全人源化单克隆抗体，其靶向作用于表皮生长因子受体(EGFR)。
[0008]根据检索，美国专利US20090384826 ((Method of determining the sensitivityof cancer cells to EGFR inhibitors including cetuximab,抗 EGFR 单克隆抗体 anderlotinib))中，提出了测定癌细胞对EGFR抑制剂包括cetuximab,抗EGFR单克隆抗体和erlotinib敏感性的方法,但是对于生产抗EGFR单克隆抗体的工艺却没有涉及。
[0009]就重组抗EGFR单克隆抗体的产业化工艺而言，现代动物细胞生物反应器培养表达技术是上述产品的关键核心技术，该技术工艺复杂、难度大。这些先进的重组蛋白生产技术掌握在国外少数制药公司手中，帮助这些跨国公司攫取高额利润。而我国比世界先进技术水平相差悬殊，是牵扯到一系列技术的整体性工业的差距。因此，我们不仅需要快速追赶，缩小差距，更需要加快技术研发，在相关领域取得跨越式发展，形成真正具有自主知识产权的重组抗EGFR单克隆抗体生产的核心关键技术。
[0010]目前，重组抗EGFR单克隆抗体的生产表达方法通常为采用批培养，分批补料培养等。这些重组蛋白生产工艺虽然已经被放大至1000L以上，但是工艺本身存在如下缺点:I)培养，表达过程的参数控制较少，不能完全或只能部分程度的控制培养环境的理化条件如温度，pH, CO2和O2浓度，营养物质浓度等；2)即使通过反应器对理、生、化条件进行精确控制，但这种控制方法仍然缺乏对细胞状态本身的精确调节和控制。处于生长和蛋白过程中的细胞状态可以极大地影响最终表达的重组蛋白质量(如蛋白质的糖基化水平，蛋白二级、三级结构的正确形成)，而细胞状态并不仅仅是通过上述理、生、化等参数对细胞的影响所能决定的，对于抗EGFR单克隆抗体这样的蛋白来说，生产获得的蛋白活性更加是远远比单纯的蛋白质量重要；3)批次培养获得的细胞的重复性较低，且极大地受到不同实验和生产技术人员个人操作的影响，在试验和生产中会出现较大的批次间差异(batch to batchvariat1n)，这也是目前药物品质控制和监管领域的难题之一。因此，一种具有简便可靠性的(robust)可大规模化(scalable)应用于工业化(industrial)抗EGFR单克隆抗体是目前表达工艺(process development)研究领域的瓶颈。
[0011 ] 此外，对于传统工艺用细胞状态“好”与“坏”来描述细胞是一种口语化的表达，而“延迟期”，“对数生长期”和“平台期”等言语也是一个较为笼统的概念，不够精确和准确。据公开报导和本公司研究部门的研究结果，细胞生长的状态与整个群体的细胞周期分布具有一定的相关性。按照细胞在分裂过程中表现出的显著性差异的行为，细胞周期可以大致分为三个阶段(图1 (图片来源于:Hwww.newearthb1med.0rgH)):gaplphase (Glphase,Gl期)是一个细胞周期的起始阶段，在这个阶段，细胞内部进行相关蛋白质的合成等行为，细胞体积和基因组不产生任何变化，随后，细胞会根据自身所处的环境来判断是否跨越过限制点(restrict1n point),进入 DNA 合成期(DNA synthesis phase, S phase, S 期)，在S期，细胞主要进行自身基因组DNA的合成复制，复制完毕后，细胞成为2倍体，即基因组翻倍，随后细胞进入有丝分裂期(gap2/mitotic phase, G2/M phase, G2/M期),在此时期,细胞完成有丝分裂，得到两个相同的子细胞，完成了一个细胞周期。当细胞所处环境不佳不利于细胞生长时，细胞无法跨过限制点，从而跳出细胞周期，进入一个额外的沉默期(restingphase, GOphase),成为不分裂细胞。根据细胞在不同周期的细胞行为，通过细胞核染色试剂检测细胞核的DNA含量，配合流式细胞仪即可分辨单个细胞所处的细胞周期并绘制整个群体的细胞周期分布图。对于正常培养过程中的细胞而言，细胞整体是一个异步培养体系(asynchronous culture),即在培养过程中细胞整体并不处于细胞周期的相同位置,而是随机分布在细胞周期的各个位置。由于处于细胞周期不同时期的细胞在蛋白过程中表现出的特性可能并不相同，因此细胞整体所呈现的结果可能实质上是由处于不同细胞周期，不同状态的细胞的所占比例的动态变化一即细胞周期分布导致的。
【发明内容】
[0012]由于细胞生长状态本身极大地影响最终表达的重组蛋白质量，而传统的细胞培养和蛋白表达方法如批培养和补料培养工艺中对于细胞状态的控制相对缺乏，同时细胞状态并不仅仅是通过上述理化参数对细胞的影响所能决定的。因此，实现对细胞生长状态(即细胞生长，细胞周期分布等具体参数)的精确控制，是建立具有简便可靠性的鲁棒化(robust)可大规模化(scalable)应用于工业化(industrial)抗EGFR单克隆抗体表达工艺(processdevelopment)的重要工作。
[0013]本发明的目的在于，针对目前单克隆抗体传统制备工艺中的上述缺点，提供一种既可在线、连续、监控多种细胞培养环境中理生化指标，又可以直接调节和控制细胞状态(包括细胞周期等)的生物反应器类细胞培养装置及由该装置生产抗EGFR单克隆抗体的方法，使其降低染菌风险，维持细胞生长环境稳定，保持细胞恒定生长活力，达到高质、高效连续生产抗EGFR单克隆抗体的目的。
[0014]对于传统工艺用细胞状态“好”与“坏”来描述细胞是一种口语化的表达，而“延迟期”，“对数生长期”和“平台期”等言语也是一个较为笼统的概念，不够精确和准确。本发明使用细胞比生长速率(μ )作为精确描述细胞生长的动力学参数，可以在一定程度上反映细胞状态。据发明人的研究结果，这一生长动力学参数与细胞周期分布、细胞在细胞周期内停留时间呈密切关系，通过特定装置组成联动系统调节，可以实现精确调控细胞状态的目标。