>[0015]本发明的上述发明目的是通过以下技术方案实现的:
[0016]一种在线工业鲁棒化调节和控制细胞状态生产抗EGFR单克隆抗体的装置，用以趋向性调节和控制细胞状态，该装置至少包括:培养液储存罐、可监控细胞生物反应器、产品收获罐、若干理生化指标检测器、在线监控系统、细胞状态调节控制装置及联动系统、细胞截留装置、若干流体无菌控速推动器和若干可控速管道体系，其中，所述培养液储存罐通过所述可控速管道体系经所述流体无菌控速推动器与所述可监控细胞生物反应器连接，所述细胞截留装置连接所述可监控细胞生物反应器，所述细胞状态调节控制装置及联动系统通过所述可控速管道体系经所述流体无菌控速推动器选择性与所述可监控细胞生物反应器或所述细胞截留装置连接，所述细胞状态调节控制装置及联动系统通过所述可控速管道体系经所述流体无菌控速推动器连接所述产品收获罐，所述可监控细胞生物反应器通过所述理生化指标检测器连接所述在线监控系统，所述在线监控系统与所述流体无菌控速推动器连接并发送控速指令给所述流体无菌控速推动器，上述所有容器类装置均通过可控速管道体系进行连接，其中，所述细胞状态调节控制装置及联动系统用于所述可监控细胞生物反应器内不同细胞比生长速率及不同细胞状态的调控。
[0017]优选地，所述细胞截留装置包括浓缩细胞出口和收获细胞出口，所述细胞状态调节控制装置及联动系统可择一与所述可监控细胞生物反应器的罐体、所述细胞截留装置的浓缩细胞出口或所述细胞截留装置的收获细胞出口相连接，所述细胞状态调节控制装置及联动系统至少包括三种工作联动方式:
[0018]第一种，当所述细胞状态调节控制装置及联动系统与所述细胞截留装置的浓缩细胞出口相连接时，其可将所述细胞截留装置中浓缩的细胞通过细胞截留装置上的排废细胞口排出，以达到所述可监控细胞生物反应器内不同细胞比生长速率及不同细胞状态的调控；
[0019]第二种，当所述细胞状态调节控制装置及联动系统与所述可监控细胞生物反应器的罐体直接相连接时，其可将所述可监控细胞生物反应器内的细胞通过所述可监控细胞生物反应器上的排废口排出，以达到所述可监控细胞生物反应器内不同细胞比生长速率及不同细胞状态的调控；
[0020]第三种，当所述细胞状态调节控制装置及联动系统与所述细胞截留装置的收获细胞出口相连接时，其可在所述细胞截留装置的不同截留效率态时将不同浓度的细胞通过作为排废细胞口的细胞截留装置的收获细胞出口排出，以达到所述可监控细胞生物反应器内不同细胞比生长速率及不同细胞状态的调控。
[0021]本发明还公开了一种在线工业鲁棒化调节和控制细胞状态生产抗EGFR单克隆抗体的方法，该方法包含以下步骤:
[0022]I)对细胞培养系统进行灭菌，然后向细胞培养系统内通入无菌的PBS缓冲液或无菌培养液，循环清洗整个细胞培养系统；
[0023]2)向细胞培养装置中接种细胞悬液，进行细胞的初级培养；
[0024]3)当细胞生长扩增到适合表达重组蛋白的细胞密度I?100X 16个细胞/ml和细胞活力70%以上时，根据培养细胞的生长特性、细胞培养装置的工作体积和在线监控系统检测的细胞培养装置中理生化指标数据设定在线监控系统的各项参数，所述在线监控系统对灌注培养抗EGFR单克隆抗体表达过程进行自动控制，将细胞培养装置中的各项指标维持在设定的最佳理生化条件，并调节细胞状态调节控制装置及联动系统的相应的流体无菌控速推动器，将细胞状态调节控制为表达抗EGFR单克隆抗体的最适宜细胞状态，使整个系统达到稳态的指标，同时自动监控和记录整个细胞培养和抗EGFR单克隆抗体表达过程；
[0025]4)生产完成后，停止培养，产物回收纯化。此外，也包括关闭在线监控系统，清洗培养装置等常规步骤。
[0026]其中优选，所述的步骤2)中，接种细胞悬液的接种密度为0.5?5 X 16个细胞/ml ο
[0027]优选地，所述的步骤2)中，所接种的细胞是用于生产抗EGFR单克隆抗体的如下工程细胞之一:CH0、HEK293、BHK 或 Per C.6。
[0028]优选地，所述的步骤3)中，所述理生化指标数据包括细胞代谢、生长速率、产物合成平衡调控数据，该些数据通过在线监测葡萄糖、乳酸、谷氨酸、谷氨酞胺、耗氧速率以及PH值指标获得，同时监测细胞比生长速率和蛋白比生成速率。
[0029]优选地，所述的步骤3)中，检测细胞培养装置中的理生化指标数据的方法为:使细胞培养装置中的培养液没过理生化指标检测器组进行检测，并将理生化指标检测器检测和转换后的信号数据返回给在线监控系统。
[0030]优选地，所述的步骤3)中，理生化指标检测器组可以检测的指标至少包括:温度，PH值，溶氧，溶二氧化碳，葡萄糖，乳酸，细胞密度，氨指标、液位。
[0031]优选地，所述的步骤3)中，在线监控系统对灌注培养抗EGFR单克隆抗体表达过程进行自动控制包括:在线监控系统接收理生化指标数据并处理，然后发出指令自动调节新鲜预处理培养液的添加速度和废细胞排出速度，维持细胞培养环境的理生化指标为设定的最佳理生化条件，其中，新鲜预处理培养液的添加速度是细胞截留装置上出液口的排出速度与排废细胞口流速之和。
[0032]优选地，所述的步骤3)中，所述最佳理生化条件至少包括:培养液添加10%_20%的血清(v/v)，若使用无血清培养液，则不添加血清；培养液温度34.5°C ±5.5°C，PH值7.0±2.0，溶氧 10% ?65%，溶二氧化碳 5%±8%。
[0033]优选地，所述的步骤3)中，在线监控系统调节控制的细胞状态指标至少包括:细胞比生长速率，细胞周期分布，细胞周期平均停留时间。
[0034]优选地，所述的步骤3)中，表达抗EGFR单克隆抗体的最适宜细胞状态至少包括:细胞周期G0/G1期细胞占35%?85%，S期细胞占10%?80%，G2/M期细胞占5%?30%且其总和为100%，细胞在G0/G1期平均停留时间3小时?80小时，S期平均停留时间3小时?40小时，G2/M期平均停留时间3小时?20小时。
[0035]优选地，所述的步骤3)中，所述整个系统的稳态的指标主要是指乳酸生成速率，葡萄糖消耗速率比值，细胞比生长速率的值保持基本稳定。
[0036]优选地，所述的步骤3)中，自动监控和记录整个细胞培养和重组蛋白表达过程为:设定在线监控系统自动记录每个指标探头监测数据和设备运行参数，自动记录的时间间隔为5?300秒，并存储数据。
[0037]优选地，所述步骤3)的过程在细胞的初级培养或次级培养阶段进行。
[0038]优选地，所述的步骤4)中，判断生产完成的标准为:细胞活率下降，或细胞总数下降明显，或蛋白表达明显降低，可通过工艺放大前的预实验结合整个系统的运行数据确定。
[0039]与现有技术相比，本发明的有益效果如下:
[0040]本发明提供的一种既可在线、连续、监控细胞培养环境中多种理生化指标，又可以直接调节和控制细胞状态(包括细胞周期等)的生物反应器类细胞培养装置及由该装置生产的方法，使抗EGFR单克隆抗体生产过程降低染菌风险，维持细胞生长环境稳定，保持细胞恒定生长活力，达到高质、高效连续生产抗EGFR单克隆抗体的目的。
【附图说明】
[0041]图1为细胞周期示意图；
[0042]图2为本发明实现可在线工业鲁棒化(industrially robust)调节和控制细胞状态生产抗EGFR单克隆抗体的装置的一种实施方式的示意图；
[0043]图3为本发明实例I的细胞的初级培养和次级培养过程细胞生长动力学图；
[0044]图4为本发明实例I的细胞的初级培养和次级培养过程细胞周期分布柱状图；
[0045]图5为本发明实例I的次级培养过程抗EGFR单克隆抗体表达图；
[0046]图6示出了本发明实例2的细胞转染结果。
【具体实施方式】
[0047]以上的描述大致说明了本发明的内容，下面的几个具体实施例将会更直接的体现本发明的情况，但必须指出的是，在此举出的实例仅仅是为了加以说明的目的，本发明并非局限于此，任何本领域的技术人员能思之的变化，都应落在本发明的保护范围内。
[0048]以下实施例中用到的可在线调节和控制CHO或HEK293细胞状态生产抗EGFR单克隆抗体的装置请参见图2，其主要包括:培养液储存罐、可监控细胞生物反应器、产品收获罐(对应图中上清液收获罐)、连接设置在可监控细胞生物反应器上的若干理生化指标检测器、在线监控系统(对应图中在线监控终端)、细胞状态调节控制装置及联动系统(工作方式包括联动方式一、联动方式二和联动方式三)、细胞截留装置、若干流体无菌控速推动器和若干可控速管道体系，其中，所述培养液储存罐通过所述可控速管道体系经所述流体无菌控速推动器与所述可监控细胞生物反应器连接，所述细胞截留装置连接所述可监控细胞生物反应器，所述细胞状态调节控制装置及联动系统通过所述可控速管道体系经所述流体无菌控速推动器选择性与所述可监控细胞生物反应器或所述细胞截留装置连接，所述细胞状态调节控制装置及联动系统通过所述可控速管道体系经所述流体无菌控速推动器连接所述产品收获罐，所述可监控细胞生物反应器通过所述理生化指标检测器连