公司生产的7L动物细胞反应器；
[0081]在线监控系统:荷兰Applicon公司生产的控制塔。
[0082]本实例中生产抗EGFR单克隆抗体的方法如下:
[0083]I)在荷兰Applicon公司生产的控制塔上设定温度37 °C，PH值7.1，溶氧浓度值45%，溶二氧化碳浓度5%，由加热套控制温度，控制塔上的流量阀自动控制C02，N2, O2, AIR四路进气用鼓泡供氧的方法控制溶氧浓度和溶二氧化碳浓度，控制塔上连接有lmol/L NaOH和lmol/L HCL的蠕动泵控制PH，根据液位电极(控制液位)的信号控制添加培养液到可监控细胞生物反应器的细胞培养装置的蠕动泵的速度；可监控细胞生物反应器的罐体上连接有补充新鲜培养液的入液口，该入液口连接培养液储存罐，可监控细胞生物反应器同时和外置式的细胞状态调节装置连接，该细胞状态调节控制装置包括细胞分离回流单元和细胞排出单元，该细胞状态调节控制装置与细胞状态的调控系统共同组成了细胞状态调节控制装置及联动系统，细胞状态调节控制装置还与产品收获罐(此处为上清液收获罐)相连接以将收获的上清液排出至该产品收获罐内；整套装置连接安装好后121°C，高压蒸汽灭菌20min，置于无菌室内，向系统内通入无菌的PBS缓冲液，循环清洗整个系统。随后，排出PBS,加入新鲜培养液，循环24h，检查是否染菌和系统运行稳定性。检验无菌后，将培养液处理至设定值，以80RPM的速度实现培养液的指标均匀；
[0084]2)细胞的初级培养
[0085]以I X 16个细胞/ml的密度制备细胞悬液，向7L动物细胞反应器(工作体积5L)中接种细胞悬液至终浓度3X 15个细胞/ml，不进行灌流培养的情况下培养96小时，待细胞扩增到5 X 16个细胞/ml的密度时开启灌流，灌流速率设为0.5个反应器罐体体积/天(即2.5L/天)，继续培养细胞72小时，培养细胞密度至9X 16个细胞/ml，细胞活力95%以上，该结果可参见图3;
[0086]3)细胞的次级培养即表达蛋白
[0087]初级培养完成后，在控制塔上设定温度35 °C，PH值7.0，溶氧浓度值35%，溶二氧化碳浓度5%，进行灌流培养和生产重组蛋白过程，灌流初始速率设为2个反应器罐体体积/天(即1L/天)，根据葡萄糖电极所测得的数据进行动态调节，将培养液中葡萄糖浓度维持在2g/L，同时在线监控系统调节细胞状态调节控制装置及联动系统的细胞回流口与废细胞排出口相连的流体控速推动器，废细胞排出口流速设置为1.5L/天，将细胞状态调节控制为细胞比生长速率为0.34CT1，细胞周期中S期细胞，G0/G1期细胞和G2/M期细胞所占比例分别为18.76%,72.15%和9.09%(请参见图4)，细胞在G0/G1期，S期和G2/M期的停留时间分别为25.91小时、12.75小时和5.7小时，细胞密度达到1.2X107个细胞/ml，细胞活力90%以上(请参见图3)，整个过程中细胞的代谢情况如图4所示；产品收获罐相应的以相同速率收获培养所得到的上清液，每天取样，对细胞密度，细胞活力和蛋白表达量进行检测，进行细胞的次级培养即蛋白表达过程，同时自动监控和记录整个细胞培养和蛋白表达生产过程，设置控制塔每30秒记录一次数据并存储；
[0088]4)生产完成
[0089]根据控制塔记录的数据，在开始灌注约48小时之后，灌流培养液进液口和出液口的蠕动泵转速基本恒定，保持在2个反应器罐体体积/天，细胞密度维持在1.2 X 17个细胞/ml，细胞活力90%以上，连续灌流培养10天后，获得足够的蛋白后，收获全部上清液，停止细胞培养与表达蛋白的过程。进行下一步的蛋白纯化、质量检验及制剂准备过程。并同时关闭在线监控系统，清洗培养装置等。该步骤中判断生产完成的标准为:细胞活率下降，或细胞总数下降明显，或蛋白表达明显降低。
[0090]根据对收获蛋白的理化性质检测结果发现，所收获蛋白的纯度和活性均和常规批次培养或者分批补料培养类似，但由于细胞密度和表达量更好，所以最终收获了更多的高活性高纯度蛋白，蛋白产量明显提高。请参见图5，使用本发明该实施例的培养装置和工艺，调节细胞培养的灌注速率，细胞保持良好的生长状态，从第5天开始表达蛋白，一直高效维持到第30天，细胞活性好，表达量维持在较高状态，各项系统控制参数良好，属于目前报道的工艺中较高水平。
[0091]本发明的装置和方法不仅可用于基于稳定重组细胞株的生物反应器过程生产重组抗EGFR单克隆抗体，同时也可以用于各种非稳定重组细胞株生物反应器过程(例如生物反应器基因转染瞬时表达过程)生产重组抗EGFR单克隆抗体。以下即是具体实施例。
[0092]实例2、可在线工业鲁棒化(industrially robust)可调控生物反应器基因转染瞬时表达过程生产重组抗EGFR单克隆抗体
[0093]本实例中用到的试剂和仪器如下:
[0094]培养液:美国Sigma生产Excell293无血清培养液；
[0095]细胞:无血清悬浮驯化HEK293细胞株；
[0096]可监控细胞生物反应器:荷兰Applicon公司生产的3L动物细胞反应器；
[0097]在线监控系统:荷兰Applicon公司生产的控制塔。
[0098]本实例中生产抗EGFR单克隆抗体的方法如下:
[0099]I)在荷兰Applicon公司生产的控制塔上设定温度37 °C，PH值7.4，溶氧浓度值40%，溶二氧化碳浓度5%，由恒温水套控制温度，控制塔上的流量阀自动控制C02，N2, O2三路进气，用overlay供氧的方法控制溶氧浓度和溶二氧化碳浓度,控制塔上连接有Imol/L NaOH和lmol/L HCL的蠕动泵控制PH，根据液位电极(液位控制)的信号控制添加培养液到细胞培养装置的蠕动泵的速度，可监控细胞生物反应器通过其罐体上设置的与培养液储存罐直接连接的入液口补充新鲜培养液，可监控细胞生物反应器还与细胞截留装置、细胞状态调节控制装置及联动系统、产品收获罐(此处为上清液收获罐)相连接，以将收获的上清液排出至上清液收获罐内，整套装置连接安装好后121°C，高压蒸汽灭菌20min，置于无菌室内，向系统内通入无菌的PBS缓冲液，循环清洗整个系统。随后，排出PBS，加入新鲜培养液，循环24h，检查是否染菌和系统运行稳定性。检验无菌后，将培养液处理至设定值，以60RPM的速度实现培养液的指标均匀；
[0100]2)细胞的初级培养
[0101]以IX 16个细胞/ml的密度制备细胞悬液，向3L动物细胞反应器(工作体积2.1L)中接种细胞悬液至终浓度4X 15个细胞/ml，不进行灌流培养的情况下培养48小时，待细胞扩增到2X106个细胞/ml的密度时开启灌流，根据葡萄糖电极所测得的数据进行动态设置灌注速率从0.5L/天?4L/天，将培养液中葡萄糖浓度维持在2g/L，同时调节细胞状态调节控制装置及联动系统的回流口(是细胞分离回流单元的实施方式之一)与废细胞排出口(是细胞排出单元的实施方式之一)相连的流体无菌控速推动器，调控细胞状态，细胞状态调节控制装置及联动系统的初始运行速率设为0.5个反应器罐体体积/天，继续培养，灌流速率不断增大至0.9个反应器罐体体积/天，继续培养细胞7天，将细胞状态调节控制为细胞比生长速率为0.6CT1，细胞周期中S期细胞，G0/G1期细胞和G2/M期细胞所占比例分别为27.52%、45.56%和26.92%，细胞在G0/G1期，S期和G2/M期的停留时间分别为8.2小时、
7.78小时和2.15小时，细胞密度达到7X 16个细胞/ml，细胞活力95%以上；
[0102]3)细胞的次级培养即细胞转染表达重组蛋白
[0103]初级培养完成后，将细胞调控至精确状态，在控制塔上设定温度33°C，PH值7.0，溶氧浓度值40%，溶二氧化碳浓度5%，停止灌流系统和细胞状态调节控制装置及联动系统，调节细胞密度至2X 16个细胞/mL，进行细胞转染和生产重组蛋白过程，每天取样，对细胞密度，细胞活力和蛋白表达量进行检测，进行细胞的次级培养即蛋白表达过程，同时自动监控和记录整个细胞培养和蛋白表达生产过程，设置控制塔每30秒记录一次数据并存储；
[0104]4)生产完成
[0105]根据控制塔记录的数据，转染后第5天细胞密度达到最大值，细胞密度为6.3 X 16个细胞/mL，抗EGFR单克隆抗体表达量在转染后第四天达到最大，连续灌流培养10天后获得足够的蛋白后，收获全部上清液，停止细胞培养与表达蛋白的过程。进行下一步的蛋白纯化、质量检验及制剂准备过程。并同时关闭在线监控系统，清洗培养装置等。
[0106]对所收获蛋白进行检测，蛋白纯度在95%以上，蛋白活性良好，符合国家法规要求的蛋白原液质量标准，由于该系统通过灌注和控制细胞生理生化参数进行精确控制培养，最终培养时间延长，收获的蛋白数量明显提高，该系统具有更好的应用价值。如图6，转染之后，细胞密度维持在较高水平，蛋白表达在第三天达到最高值，然后持续到细胞密度下降，整个工艺时间长，细胞状态和活性好，最终收获了比传统系统更多的蛋白，提高了效率，降低了成本。
[0107]在本发明及上述实施例的教导下，本领域技术人员很容易预见到，本发明所列举或例举