述纳米金与药物损伤的双链DNA可以通过常规的方式连接，优选 地，所述药物损伤的双链DNA与纳米金通过S-Au键相连。例如，可以将巯基修饰到药物损 伤的双链DNA中未损伤链的末端(如5'-端)，促使药物损伤的双链DNA通过S-Au键与纳米 金相连。
[0034] 本发明提供的制备上述损伤DNA-纳米金复合物的方法包括将药物损伤的双链 DNA与纳米金接触，以使药物损伤的双链DNA与纳米金相连。
[0035] 根据本发明，在接触体系中，药物损伤的双链DNA和纳米金的摩尔比优选为 250-500:1。
[0036] 根据本发明，所述接触的条件可以为常规的将DNA与纳米金相连的条件，优选情 况下，所述接触的方式为：在25-38°C下孵育1-2. 5h，加入氯化钠并使氯化钠在接触体系中 的终浓度为〇. 05-0. 15M，再于3-5°C下静置10_15h。为了更好地抑制裸露的纳米金表面对 蛋白的非特异性吸附，本发明的方法还包括往接触体系中添加巯基修饰的聚乙二醇(可商 购获得)，巯基修饰的聚乙二醇与纳米金的摩尔比可以为50-100:1。
[0037] 本发明还提供了由上述方法制得的损伤DNA-纳米金复合物。
[0038] 本发明提供的捕获药物损伤DNA应答蛋白的方法包括以下步骤：
[0039] (1)将上述本发明的损伤DNA-纳米金复合物（也称为阳性探针)、没有被药物损伤 的对照DNA-纳米金复合物（也称为对照探针）与细胞裂解液混合，以使损伤DNA-纳米金复 合物与药物损伤DNA应答蛋白结合，所述对照DNA-纳米金复合物中，1摩尔的纳米金上结合 有7-12摩尔的双链DNA，所述对照DNA-纳米金复合物中的双链DNA与所述损伤DNA-纳米 金复合物中的药物损伤的双链DNA的碱基序列相同；
[0040] (2)除去未结合的蛋白，从而分离出捕获的蛋白；
[0041] (3)鉴定捕获的蛋白；
[0042] (4)应用基于稳定同位素标记的定量蛋白质组学方法对捕获的蛋白进行定量比 较，排除非特异性的DNA结合蛋白，从而得到特异性识别药物损伤DNA应答蛋白。
[0043] 步骤（1)中，对照DNA-纳米金复合物与本发明的损伤DNA-纳米金复合物区别仅 在于，本发明的损伤DNA-纳米金复合物中的药物损伤的双链DNA上结合有药物，而对照 DNA-纳米金复合物中没有。步骤（1)中，考虑到充分捕获细胞裂解液中的药物损伤DNA应 答蛋白，所述损伤DNA-纳米金复合物（以纳米金的重量计)与细胞裂解液中总蛋白的重量比 优选为0. 2-0. 4:1。而使用现有商品化材料捕获药物损伤DNA应答蛋白的方法中，该重量比 远大于1，可以看出，本发明只需少量捕获材料及细胞裂解液即可捕获足量的药物损伤DNA 应答蛋白。混合的条件可以包括：温度为3-5°C，时间为10_15h。
[0044] 步骤（2)中，可以通过离心弃上清液的方式除去未结合的蛋白，如16000_17500g 离心10-15min。步骤（3)中，可以采用胰蛋白酶酶解蛋白，从而通过LC-MS/MS鉴定捕获的 蛋白。此外，还可以通过Western Blot分析的方法鉴定捕获的蛋白，具体操作为本领域技 术人员所公知，在此不再赘述。
[0045] 本发明中，通过步骤（4)可以对捕获的药物损伤DNA应答蛋白进行特异性分析，从 而确定使用的损伤DNA-纳米金复合物能够特异性捕获药物损伤DNA应答蛋白，该方法的具 体操作步骤为本领域技术人员所公知，在此不再赘述。
[0046] 本发明还提供了上述本发明的损伤DNA-纳米金复合物在药物损伤DNA应答蛋白 的捕获和/或鉴定中的应用。
[0047] 以下将通过实施例对本发明进行详细描述。以下实施例中，人乳腺癌细胞(MCF-7) 细胞购自ATCC，ATCC编号为HTB-22?;培养MCF-7细胞所用培养基的组成是：DMEM (高 糖）中添加抗生素（l〇〇U/mL的青霉素和100mg/mL的链霉素）和10%的胎牛血清（FBS)， 其中，DMEM和FBS均购自HyClone公司；裂解细胞使用的RIPA裂解液购自Bioteke公 司，裂解液的成分为：50mM Tris (pH7. 4)，150mM NaCl，l%Triton X-100，l% 脱氧胆酸 钠 （sodium deoxycholate)，0.1%SDS，以及正 f凡酸钠 （sodium orthovanadate)，氟化钠 (sodium fluoride), EDTA，亮抑酶肽（Ieupeptin);细胞裂解液中总蛋白含量测定使用BCA 蛋白质定量试剂盒(天根生化科技(北京）有限公司）进行测定；四条单链DNA委托大连宝 生物公司合成；顺钼购自于Alfa Aesar公司；反式钼噻唑化合物（trans-PtTz)按照文献 "M. Van Beusichem. Inorganic Chemistryl992, 634-639" 中的方法合成；憐酸盐缓冲溶液 为50mM的PBS缓冲液（ρΗ7· 4);胰蛋白酶(质谱级）购自Promega公司；0· 45 μ m的PVDF膜 购自Millipore, HMGBl的Western Blot分析使用的一抗和二抗购自Abeam ;ECL试剂盒购 自Tiangen公司。
[0048] 实施例1
[0049] 本实施例用来说明本发明的顺钼损伤DNA-纳米金复合物的制备与表征。
[0050] 双链 DNA 的序列为：5' -CCTCTCTGGACCTTCC-3'（DNA1，SEQ ID N0:1)， HS-5' -GGAAGGTCCAGAGAGG-3'（DNA2, SEQ ID N0:2)。
[0051] 将顺钼和单链DNAl以摩尔比0. 8:1在37°C下孵育2天，反应混合液通过HPLC分 离得到纯的顺钼交联DNAl，所用色谱柱为C8柱（4. 6mmX 250mm，5 μ m，Agilent )，流动相为 均含有20mM的TEAA的水和乙腈。纯化的顺钼交联DNAl在水溶液中透析(透析袋截留分子 量为lkD)5小时以除去乙腈和TEAA，紫外测定顺钼交联DNAl的量，冻干后和等量的互补链 DNA2在pH为7. 5的含IOmM Tris，50mM NaCl，lmM EDTA的缓冲液中退火形成顺钼损伤的双 链DNA。直接将DNAl按相同的条件退火得到无损伤的双链DNA，作为对照。
[0052] 按照文献"Grabar, K. C. Analytical Chemistryl995, 735-743" 通过朽1 樣酸钠还 原的方法制备IOnM的纳米金(平均粒径为IOnm)溶液，对于对照DNA-纳米金复合物(对照 探针)，0. 2mL纳米金加入1.0 nmol无损伤的双链DNA ;对于损伤DNA-纳米金复合物（阳性 探针)，0. 2mL纳米金加入1.0 nmol顺钼损伤的双链DNA，另外，阳性探针和对照探针各加入 0.2nmol巯基修饰的聚乙二醇(购自Rapp Polymere股份有限公司，德国）。37°C下孵育2h, 加入NaCl使终浓度为0. 1M，4°C下静置10h。探针用PBS缓冲液洗涤一次并重悬于PBS溶 液中（浓度为50mM)。
[0053] 制备的探针经过透射电镜及动态光散射表征粒径的大小，紫外吸收光谱表征最大 吸收波长的变化，结果如图1所示(其中，图IA为透射电镜照片，图IB为紫外吸收光谱图)， 动态光散射平均粒径（nm)为16. 1±1.0。从修饰到纳米金表面的荧光标记的双链DNA的荧 光强度可以算出，制得的损伤DNA-纳米金复合物中，1摩尔的纳米金上结合有10摩尔的药 物损伤的双链DNA。
[0054] 实施例2
[0055] 本实施例用来说明本发明捕获顺钼损伤DNA应答蛋白的方法。
[0056] (1)肿瘤细胞的培养与全蛋白的提取
[0057] 培养MCF-7,于IOOmm培养皿中培养至长满培养皿，除去培养基，用胰蛋白酶收集 细胞，用于细胞裂解提取蛋白。细胞经PBS缓冲液洗涤后，加入200 μ L含新加入PMSF的 RIPA裂解液，4°C下裂解0. 5h，然后于4°C下13000g离心4min，上清即细胞裂解液，经过BCA 试剂盒测定蛋白的含量，具体操作还可以参照文献"Akins, R. E. ; Tuan, R. S. BioTechniques .1992, 12, 469-499"。
[0058] (2)捕获顺钼损伤DNA应答蛋白
[0059] 将0. 2mL制备的阳性探针(实施例1获得的顺钼损伤的DNA-纳米金复合物)和对照 探针分别加入PBS缓冲液稀释至0. 4mL，两者分别与等量的细胞裂解液(含100 μ g总蛋白） 混合，在3°C下孵育15h。离心（17000g，IOmin)去除没有结合的蛋白溶液