一种损伤dna-纳米金复合物及其制备方法与应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于蛋白质富集、分离和检测领域，具体地，涉及一种损伤DNA-纳米金复 合物及其制备方法，该损伤DNA-纳米金复合物捕获药物损伤DNA应答蛋白的方法，以及该 损伤DNA-纳米金复合物在药物损伤DNA应答蛋白的捕获和/或鉴定中的应用。
【背景技术】
[0002] 以顺钼为代表的钼类抗肿瘤药物是细胞毒性抗肿瘤药物的典型代表。自1969年 Rosenberg发现顺钼（Cisplatin)抑制细胞生长的生物活性以来，顺钼已成为临床上使用 最为广泛的抗肿瘤药物，第二代钼类药物卡钼、奥沙利钼等也已相继进入临床使用。顺钼 进入人体后，可扩散通过带电的细胞膜，进入细胞质内，被转运至细胞核，在染色质内和DNA 形成一种链内交联复合物。高迁移率族蛋白I (HMGB1，high mobility group proteinl) 能特异性地结合顺钼与DNA形成的1，2-d(GpG)链内交联产物，阻止核酸切割酶对DNA的修 复，抑制DNA的转录和复制，导致细胞凋亡或坏死。
[0003] 迄今为止，人们对不同肿瘤细胞对金属抗肿瘤药物DNA损伤的分子应答机制及其 差异还知之甚少。所以，从分子水平上研究DNA结合蛋白与损伤DNA-药物复合物的相互识 别和相互作用，以及这种分子识别作用对细胞药物应答灵敏度的影响，对深入理解细胞毒 性抗肿瘤药物的作用机理，进一步优化它们的分子设计具有非常重要的意义，也是药物发 现领域所面临的最具挑战性的课题之一。
[0004] 目前，捕获钼损伤DNA应答蛋白的方法包括：将含有光捕获基团的钼损伤DNA负载 到磁珠表面或者将钼损伤DNA负载到糖球表面与大量的核蛋白溶液孵育以捕获应答蛋白。 这些方法的主要不足是：由于磁珠或糖球等材料不溶于水，结合过程为非均相结合，所以需 要使用大量的肿瘤细胞裂解液；而且没有设置对照，易将非特异性捕获的蛋白质作为应答 蛋白；而且由于引入了光捕获试剂，钼损伤DNA的结构并不是生理条件下的结构，因此捕获 的蛋白不一定是生理条件下的应答蛋白。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是克服现有技术需要大量细胞裂解液且特异性较低的缺陷，提供一 种使用少量细胞裂解液即可实现捕获且特异性高的损伤DNA-纳米金复合物及其制备方 法、该损伤DNA-纳米金复合物捕获药物损伤DNA应答蛋白的方法以及该损伤DNA-纳米金 复合物在药物损伤DNA应答蛋白的捕获和/或鉴定中的应用。
[0006] 为了实现上述目的，第一方面，本发明提供了一种损伤DNA-纳米金复合物，该损 伤DNA-纳米金复合物中，1摩尔的纳米金上结合有7-12摩尔的药物损伤的双链DNA。
[0007] 第二方面，本发明提供了一种制备第一方面所述的损伤DNA-纳米金复合物的方 法，该方法包括将药物损伤的双链DNA与纳米金接触，以使药物损伤的双链DNA与纳米金相 连。
[0008] 第三方面，本发明提供了由第二方面所述的方法制得的损伤DNA-纳米金复合物。
[0009] 第四方面，本发明提供了一种捕获药物损伤DNA应答蛋白的方法，该方法包括以 下步骤：
[0010] (1)将第一方面和/或第三方面所述的损伤DNA-纳米金复合物（也称为阳性探 针)、没有被药物损伤的对照DNA-纳米金复合物(也称为对照探针)与细胞裂解液混合，以使 损伤DNA-纳米金复合物与药物损伤DNA应答蛋白结合，所述对照DNA-纳米金复合物中，1 摩尔的纳米金上结合有7-12摩尔的双链DNA，所述对照DNA-纳米金复合物中的双链DNA与 所述损伤DNA-纳米金复合物中的药物损伤的双链DNA的碱基序列相同；
[0011] (2)除去未结合的蛋白，从而分离出捕获的蛋白；
[0012] (3)鉴定捕获的蛋白；
[0013] (4)应用基于稳定同位素标记的定量蛋白质组学方法对捕获的蛋白进行定量比 较，排除非特异性的DNA结合蛋白，从而得到特异性识别药物损伤DNA的应答蛋白。
[0014] 第五方面，本发明提供了第一方面和/或第三方面所述的损伤DNA-纳米金复合物 在药物损伤DNA应答蛋白的捕获和/或鉴定中的应用。
[0015] 通过上述技术方案，本发明的损伤DNA-纳米金复合物仅需要少量细胞裂解液即 可实现药物损伤DNA应答蛋白的捕获，且蛋白捕获特异性高。此外，将本发明的损伤DNA-纳 米金复合物用于捕获药物损伤DNA应答蛋白时，通过简单的离心步骤即可将捕获的药物损 伤DNA应答蛋白与其他蛋白分离，简化了操作。
[0016] 本发明的其他特征和优点将在随后的【具体实施方式】部分予以详细说明。
【附图说明】
[0017] 附图是用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与下面的具 体实施方式一起用于解释本发明，但并不构成对本发明的限制。在附图中：
[0018] 图1为按照实施例1的方法制得的顺钼损伤DNA-纳米金复合物探针的透射电镜 照片（图1A)及紫外吸收光谱表征图（图1B);
[0019] 图2为按照实施例1的方法制得的顺钼损伤DNA-纳米金复合物探针从MCF-7细 胞裂解液中捕获到的蛋白HMGBl的胰蛋白酶酶解肽段的二级质谱图；
[0020] 图3为按照实施例1的方法制得的顺钼损伤DNA-纳米金复合物探针从MCF-7细 胞裂解液中捕获到的蛋白HMGBl的Western Blot结果图，从左往右依次是细胞裂解液中的 HMGBl (分子量为25KD)，阳性探针捕获到的HMGBl ;
[0021] 图4为实施例2中的阳性探针和对照探针从MCF-7细胞裂解液中捕获到的HMGBl 的胰蛋白酶酶解肽段的质谱定量结果；
[0022] 图5为按照实施例3的方法制得的反式钼噻唑化合物（trans-PtTz)损伤DNA-纳 米金复合物探针从MCF-7细胞裂解液中捕获到的蛋白TCP4的胰蛋白酶酶解肽段的二级质 谱图；
[0023] 图6为实施例4中的阳性探针和对照探针从MCF-7细胞裂解液中捕获到的TCP4 的胰蛋白酶酶解肽段的质谱定量结果。
【具体实施方式】
[0024] 以下对本发明的【具体实施方式】进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体 实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。
[0025] 在本发明中，在未作特殊说明的情况下，术语"药物损伤的双链DNA"是指双链DNA 与能够共价或配位结合DNA的药物接触后，双链DNA中的至少一条链与所述药物相结合而 形成的交联产物，即，是共价或配位结合有药物的双链DNA，需要说明的是，结合药物并不会 改变双链DNA的碱基序列；"药物损伤DNA应答蛋白"是指能够特异性地结合药物损伤的双 链DNA的蛋白质，部分药物损伤DNA应答蛋白可以修复损伤的DNA，导致细胞对药物产生耐 受性,也有一部分药物损伤DNA应答蛋白可以阻止损伤DNA被修复，从而增加肿瘤细胞对药 物的敏感性。
[0026] 本发明提供的损伤DNA-纳米金复合物中，1摩尔的纳米金上结合有7-12摩尔的药 物损伤的双链DNA。
[0027] 根据本发明，对所述双链DNA没有特别的要求，可以为各种能够与抗肿瘤药物形 成链内交联复合物从而抑制肿瘤细胞生长的双链DNA。优选地，所述药物损伤的双链DNA的 长度为9-45bp，结合有药物的链中间具有1-2个鸟嘌呤。例如，当抗肿瘤药物为顺钼时，可 以使用两条链的喊基序列分别如下所不的双链DNA :
[0028] 5, -CCTCTCTGGACCTTCC-3' （SEQ ID N0:1)
[0029] 5' -GGAAGGTCCAGAGAGG-3' （SEQ ID N0:2)
[0030] 需要说明的是，药物损伤的双链DNA中，各种常规药物与双链DNA的结合方式为本 领域技术人员所熟知，在此不再赘述。
[0031] 根据本发明，对所述药物没有特别的限制，可以为能够与双链DNA形成链内交联 复合物从而抑制肿瘤细胞生长的药物。优选地，所述药物为钼类抗肿瘤药物，所述钼类抗肿 瘤药物的通式更优选为[Pt( II )A2X2]，其中，A2为2个单齿氨配体或1个双齿氨配体，更 优选为NH3或NH2C 2H4NH2 ;X2为2个单齿阴离子配体或一个双齿阴离子配体，更优选地，单齿 阴离子配体为C1。最优选地，所述药物为cis-[PtCl 2(NH3)2]和/或trans-[PtCl2(NH 3)(噻 唑）]。
[0032] 根据本发明，对所述纳米金的粒径没有特别的要求，只要能够结合DNA即可，优选 情况下，所述纳米金的平均粒径为10-40nm，最优选为l〇-18nm。
[0033] 根据本发明，所