一种p2y1/u2os细胞株及其制备方法及应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种P2Y1/U20S细胞株及其制备方法及应用，属于药物高通量筛选检测技术领域。
【背景技术】
[0002]P2Y1受体属于G蛋白偶联受体，在人的心、脑、血管、胎盘、肝、肺等组织中均有表达。P2Y1受体与Gq蛋白相偶联，该受体被活化时，可以激活憐脂酶Cβ (ΡΙΧβ)、蛋白激酶C(PKC)，促进细胞内钙动员。近年来的研宄表明，Ρ2Υ1受体在血小板的激活、血管舒张以及动脉粥样硬化中起着重要作用。例如:ADP与Ρ2Υ1受体结合后，会触发Gq通路，引起胞浆钙离子水平升高，从而使血小板发生快速可逆的聚集。在内皮细胞中，Ρ2Υ1受体的激活可以通过一氧化氮依赖的机制导致冠状血管舒张。溶血磷脂酸(LPA)会导致血小板激活以及血小板-单核细胞聚合物的形成从而形成血管斑块，该作用可以被Ρ2Υ1受体拮抗剂阻断。Ρ2Υ1受体还可以调控细胞的增殖、转移、凋亡和死亡过程。在黑色素瘤、直肠结肠肿瘤和脑部肿瘤以及其他细胞系中，Ρ2Υ1受体激活导致肿瘤细胞数量减少。在人前列腺癌PC-3细胞中，Ρ2Υ1受体激活导致细胞生长抑制和死亡，提示Ρ2Υ1受体有希望成为前列腺癌的新型治疗革巴点。
[0003]目前，抗血小板药物，如氯吡格雷、普拉格雷，已经上市多年，应用广泛，疗效确切，但是也存在氯吡格雷抵抗、出血风险等问题；近年来，以Ρ2Υ1受体为靶点的抗血小板化合物研宄日渐深入，核苷酸衍生物MRS2179是Ρ2Υ1受体的选择性拮抗剂，在体内、体外均具有抗血栓活性，是最常用的研宄Ρ2Υ1受体的工具药，但是存在口服生物利用度低的缺陷。本研宄通过构建荧光标记人Ρ2Υ1蛋白细胞株，运用高通量筛选的手段，希望发现一些非核苷酸类、便于口服的Ρ2Υ1受体激动剂或拮抗剂。
【发明内容】
[0004]本发明的目的在于提供一种P2Y1/U20S细胞株的制备方法，具体包括以下步骤: Cl)构建人Ρ2Υ1受体荧光蛋白GFP真核表达载体P2Y1/PCMV6 ；
(2)按Lipofectamine2000操作说明书进行转染人骨肉瘤U20S细胞，G418加压筛选2周，获得具有抗生素抗性的阳性细胞克隆，扩增培养即为稳定表达人P2Y1的U20S细胞系，命明为P2Y1/U20S细胞株。
[0005]本发明所述焚光蛋白为GFP (green fluorescence protein)或任何具有焚光性质的蛋白，其中GFP是绿色光蛋白。
[0006]本发明的另一目的在于提供所述的P2Y1/U20S细胞株用于测定P2Y1受体激动剂或拮抗剂生物活性的方法，包括如下步骤:转染了 GFP标记的P2Y1受体基因条件下(GFP直接标记P2Y1的C末端)，在受体激动剂刺激下诱导P2Y1/U20S细胞内产生荧光斑点，用高内涵系统观察分析测定P2Y1/U20S细胞内荧光斑点数目，检测P2Y1受体激动剂或抑制剂的生物活性。
[0007]本发明所述的受体激动剂为ΑΤΡ，P2Y1受体与配体结合后细胞内产生荧光斑点数目与受体激动剂的活性呈正相关，用高内涵系统观察分析测定P2Y1/U20S细胞内荧光斑点数目，测定受体激动剂的生物活性。
[0008]本发明的有益效果:
(I)本发明用P2Y1/U20S细胞株来检测P2Y1受体激动剂、拮抗剂，所述该检测方法易标准化，重复性好，具有P2Y1受体特异性、成本低、准确和方便的特点，具有良好的应用前景；(2 )本发明提供了荧光标记人P2Y1受体蛋白细胞株P2Y1/U20S，相比国内的筛选方法如均相时间分辨荧光技术(HTRF)具有操作简单，形象直观，略去了加入Buffer、一抗、二抗的繁琐步骤，降低了检测成本。由于本发明提供的是直接检测受体与配体作用后的反应，所以有着更高灵敏度与特异性，大大降低假阳性的发生，并且可以针对中草药混合物进行筛选。
【附图说明】
[0009]图1 GFP标记P2Y1示意图；
图2重组真核表达载体P2Yl/pCMV6示意图；
图3高内涵系统观察分析细胞表面P2Y1的表达情况结果；
图4高内涵系统观察分析刺激后细胞内形成荧光斑点；
图5 P2Y1/U20S细胞经ATP激活后活性反应结果。
【具体实施方式】
[0010]下面结合附图，用本发明的实施例来进一步说明本发明的实质性内容，但并不以此来限定本发明。
[0011]实施例1
GFP荧光标记人P2Y1受体真核表达载体P2Yl/pCMV6的构建，P2Y1/U20S细胞株的建立，以及P2Y1/U20S细胞内荧光斑点平均数目变化检测P2Y1受体激动剂。
[0012]一、GFP荧光标记人P2Y1受体(如图1所示)真核表达载体P2Yl/pCMV6的构建(如图2所示):
(I)人P2Y1 cDNA (购自OriGene公司)扩增:以人P2Y1 cDNA为模板，采用PCR的方式扩增全长人P2Y1 cDNA编码区，全长1119bp ；
其上游引物:5，-gaggcgatcgccATGACCGAGGTGCTGTGGCCGGC-3，；
下游引物:5 ’ -gcgacgcgtCAGGCTTGTATCTCCATTCTGCTTG-3 ’(引物由硕阳生物科技有限公司合成)。
[0013](2 )回收、纯化PCR产物，连接到PMD18-T Vector上，获得重组质粒P2Yl/pMD18_T，利用限制性内切酶没./!和Mlul对质粒进行酶切。
[0014](3)用限制性内切酶 SgfY 和 Mlul 酶切质粒 G-D (pCMV6_AC-GFP_DR5)。
[0015](4)回收酶切产物，在16°C连接8小时，获得重组质粒P2Yl/pCMV6，按照OMEGA去内毒素质粒大量提取试剂盒说明书提取P2Yl/pCMV6质粒。
[0016]基因序列的克隆PCR反应体系为50 yL，由5 μ L 1XEx-Taq buffer U μ LEx-Taq DNA 聚合酶 5 U/yL、3 μ L 2.5 mM dNTP、l μ L 上游引物 10 pmol/ μ LU yL 下游引物 10 pmol/ μ LU μ L 质粒(BC113493) 100 ng/yL和 38 μ L 无菌水组成；PCR反应条件:95°C预变性5 min，95°C变性I min，65°C退火0.5 min，72°C延伸I min，共30个循环，72°C延伸 10 min ;所用的 1XEx -Taq buffer 中含有 Mg2+。
[0017]回收PCR产物连接到PMD18-T Vector反应体系为10 μ L，由5 yL回收PCR产物、4.5 yL