D-TNSBCu释放 VEGF-siRNA的电泳实验图。
[0038] 图5为本发明手性四核铜基有机金属框对鼠动脉环出芽抑制作用结果图。
【具体实施方式】
[0039] 以下结合具体实施例来进一步解释本发明，但实施例对本发明不做任何形式的限 定。
[0040] 实施例1 L-TNSBCu的制备
[0041] (I) L-苯丙氨醇（5. Ommol)和氢氧化钾（10.0 mmol)置于IOOmL的磨口烧瓶中，加 入25mL的无水甲醇，回流冷凝，50°C恒温、磁力搅拌溶解。然后，加入5-溴-2-羟基-3-甲 氧基苯甲醛（5.0mmol)，继续在50°C恒温搅拌，回流冷凝，反应2.5h，溶液呈黄色。停止反 应，用旋转蒸发仪蒸出大部分的无水甲醇，得到黄色固体，过滤。将固体用少量无水甲醇洗 涤、无水乙醚洗涤，然后真空干燥2天，得黄色固体，即L-型的席夫碱配体（L-SB)。
[0042] (2)于 IOOmL 的圆底烧瓶，将配体 L-SB(0. 2mmol)与 Cu(NO3)2 · 3Η20(0· 3mmol)混 合，用17mL 95%的乙醇溶解，回流冷凝，50°C恒温、磁力搅拌溶解，反应15min后，将邻菲 罗啉（0. 2mmol)用2mL 95%的乙醇溶解，加入到上述溶液中，继续55°C恒温、磁力搅拌、回 流反应12h。反应结束后，过滤。将深绿色的滤液静置，自然挥发。若干天后，得到六角板 块形貌的绿色单晶，即 L- [Cu4 (C17H16NO3Br) 2 (C17H17NO3Br) 2 (H2O) 2] 2 (NO3) 4 · 3 (H2O)(简写为 L-TNSBCu)。其扫描电镜图如图1(a)所示。
[0043] L- [Cu4 (C17H16NO3Br) 2 (C17H17NO3Br) 2 (H2O) 2] 2 (NO3) 4 · 3 (H2O)的晶体结构归属于 单斜晶系，C2 空间群，α = 24.7907Α，Λ= 18.3718A，c'= 18.5083A,，β = 108. 740 ° ; F=7982.7A3;其单晶结构图如图2(a)所示。
[0044] 实施例2 D-TNSBCu的制备
[0045] (I)D-苯丙氨醇（5. Ommol)和氢氧化钾（10.0 mmol)置于IOOmL的磨口烧瓶中，加 入IOmL的无水甲醇，回流冷凝，50°C恒温、磁力搅拌溶解。然后，加入5-溴-2-羟基-3-甲 氧基苯甲醛（5. Ommol)，立刻有黄色沉淀，继续在50°C恒温搅拌，回流冷凝，反应2. 5h，出现 大量黄色沉淀。停止反应，用旋转蒸发仪蒸出少量的无水甲醇，得到黄色固体，过滤。将固 体用少量无水甲醇洗涤、无水乙醚洗涤，然后真空干燥2天，得黄色固体，即D-型的席夫碱 配体（D-SB)，
[0046] (2)于 IOOmL 的圆底烧瓶，将配体 D-SB(0. 2mmol)与 Cu(NO3)2 · 3Η20(0· 3mmol)混 合，用15mL 95%的乙醇溶解，回流冷凝，50°C恒温、磁力搅拌溶解，反应30min后，将邻菲罗 啉（0.2mmol)加入到上述溶液中，继续55°C恒温、磁力搅拌、回流反应12h。反应结束后，过 滤。将深绿色的滤液静置，自然挥发。若干天后，得到六角板块形貌的绿色单晶，即D-[Cu 4(C17H16N03Br)2(C 17H17N03Br)2(H20) 2]2(N03)4 ·3(Η20)(简写为 D-TNSBCu)。其扫描电镜图如图 I (b)所示。
[0047] D- [Cu4 (C17H16NO3Br) 2 (C17H17NO3Br) 2 (H2O) 2] 2 (NO3) 4 · 3 (H2O)的晶体结构归属于单 斜晶系，C2 空间群，fl = 24.8501A，? = 18.4141A，c = 18.5435A,，β = 108. 747 ° ; K= 8035.2 A3;其单晶结构图如图2(b)所示。
[0048] 实施例3纳米级L-TNSBCu和D-TNSBCu单晶的制备
[0049] 将L-TNSBCu和D-TNSBCu的单晶用乙醇和水（3:2)混合溶剂充分溶解，制备成饱 和溶液，轻轻地置于铜网上，自然晾干，得纳米级L-TNSBCu和D-TNSBCu。用透射电镜观察铜 网上L-TNSBCu和D-TNSBCu纳米粒子的形貌。分别见图3 (b)，3 (d)所示。
[0050] 实施例4纳米级L-TNSBCu和D-TNSBCu单晶的制备
[0051] 用水做溶剂，分别将L-TNSBCu和D-TNSBCu的单晶用蒸馏水溶解，制备成过饱和溶 液，静置沉降后，取上层清液10 yL,然后加用5 yL蒸馏水稀释混匀，静置过夜，而D-TNSBCu 样品则取上层清液15 μ L，静置过夜，得纳米级L-TNSBCu和D-TNSBCu单晶。分别见图 3(a)，3(c)所示。
[0052] 实施例5纳米复合物L-TNSBCu/VEGF-SiRNA的制备
[0053] (1)取 4 μ L 20 μ M 的 VEGF-SiRNA 用 20 μ L 的 DEPC 水稀释。
[0054] (2)配合物L-TNSBCu用乙醇/水（体积比为3:2)制成饱和溶液。
[0055] (3)取5 μ L饱和的L-TNSBCu溶液与10 μ L稀释的VEGF-SiRNA溶液，混合均匀， 37°恒温孵育了 3h，滴到铜网上晾干，即得L-TNSBCu/VEGF-SiRNA。
[0056] 实施例6纳米复合物D-TNSBCu/VEGF-SiRNA的制备
[0057] (1)取 4 μ L 20 μ M 的 VEGF-SiRNA 用 20 μ L 的 DEPC 水稀释。
[0058] (2)配合物D-TNSBCu用乙醇/水（体积比为3:2)制成饱和溶液。
[0059] (3)取5 μ L饱和的D-TNSBCu溶液与10 μ L稀释的VEGF-SiRNA溶液，混合均匀， 37°恒温孵育了 3h，滴到铜网上晾干，即得D-TNSBCu/VEGF-SiRNA。
[0060] 实施例7琼脂糖凝胶电泳实验
[0061] 分别制备 L-TNSBCu/VEGF-siRNA 和 D-TNSBCu/VEGF-siRNA 复合物：先用双蒸水 分别把L-TNSBCu和D-TNSBCu溶解，形成饱和溶液Iug/ μ L，取之配制0. 5 μ g/ μ L的储备 溶液；按照说明书将VEGF-siRNA用DEPC水稀释约0. 264 μ g/ μ L (20 μ Μ)的溶液；分别按 照质量比（L/D - TNSBCu :VEGF-siRNA)80:l、40:l、20:l、10:l、5:l、2. 5:1 配制 L - TNSBCu/ VEGF-siRNA 复合物及 D - TNSBCu/VEGF-siRNA 复合物，以 siRNA 和 Naked-siRNA 为参比，各 样品的总体积20 μ L，然后在37°C恒温孵育2. 5h。然后进行琼脂糖凝胶电泳，调电压100V， 电泳约20min。结果见图4。
[0062] 如图4 (a)为检测L-TNSBCu或D-TNSBCu负载VEGF-siRNA的电泳实验图。由 图4(a)中可以看出两个参比siRNA和Naked-siRNA在电泳后，条带清晰、明亮，说明未经 L-TNSBCu或D-TNSBCu孵育过的VEGF-siRNA，在电泳中的迀移量没有变化，而当VEGF-siRNA 分别被 L-TNSBCu 或 D-TNSBCu 孵育后，VEGF-siRNA 的条带，根据 VEGF-siRNA 与 L-TNSBCu 或 D-TNSBCu不同的质量比，出现了条带亮度减弱，甚至没有了的现象，这说明了 L-TNSBCu和 D-TNSBCu都有不同程度地负载VEGF-siRNA的能力，使能在电泳中自由迀移的VEGF-siRNA 不同程度地减少。
[0063] 图4 (b)为检测L-TNSBCu或D-TNSBCu负载VEGF-siRNA免受RNAse降解的电泳实 验图。具体方法为参照上述电泳方法，各样品再加入浓度为〇. 25mg/mL的RNAse A溶液2 μ L 进行电泳实验。由图4(b)可以看出，只有参比siRNA在电泳后有清晰、明亮的VEGF-siRNA 条带出现，其余的上样孔都没有出现任何VEGF-siRNA条带，说明那些没有被L-TNSBCu或 D-TNSBCu载体负载的VEGF-siRNA都已经被RNAse酶解了所以没有出现VEGF-siRNA条带。 此外，DNAse A也能使没有被L-TNSBCu或D-TNSBCu载体负载的VEGF-siRNA酶解。
[0064] 图4 (c)为检测L-TNSBCu或D-TNSBCu释放VEGF-siRNA的电泳实验图，具体方法为 参照上述电泳方法，DNAse A用过量的EDTA失活后，各样品再加入1. 0%的SDS 2. 0 μ L和 5 XPBS溶液5uL进行电泳实验。图4 (c)的结果表明，对于L - TNSBCu而言，当L - TNS