BCu 与VEGF-siRNA的质量比为5~10之间，因这个范围处于L - TNSBCu对VEGF-siRNA有最好 的负载能力，负载的VEGF-siRNA的量最多，因此最终被释放出来的VEGF-siRNA的量也最 多；对于D - TNSBCu而言，当D - TNSBCu与VEGF-siRNA的质量比为20~40之间，因这个范 围处于D - TNSBCu对VEGF-siRNA有最好的负载能力，负载的VEGF-siRNA的量最多，因此最 终被释放出来的VEGF-siRNA的量也最多。
[0065] 本实施例表明了手性的L-TNSBCu和D-TNSBCu都具有负载VEGF-siRNA的能力， L - TNSBCu负载VEGF-siRNA的最佳结合比为5 :1 (质量比）；D - TNSBCu负载VEGF-siRNA 的最佳结合比为20 :1 (质量比）；被L-TNSBCu和D-TNSBCu载体负载了的VEGF-siRNA可以 免受RNAse酶解作用。
[0066] 实施例8 L - TNSBCu和D - TNSBCu体外细胞毒性实验
[0067] MTT法：取处于对数生长期的肿瘤细胞，调整活细胞浓度为2 X IOVml加于96孔培 养板，每孔100 μ 1，在培养箱中培养24h待贴壁后，再分别加入不同浓度受试样品100 μ 1， 加样组设4个复孔，置37°C，5 % CO2培养48h，然后加入MTT (5mg/ml) 20 μ 1/孔，4h后离心 弃上清液，加入二甲基亚砜（DMSO) 100 μ 1/孔，振荡IOmin左右，用酶标仪在570nm波长下 测定OD值。计算细胞存活率，通过软件计算其半数抑制浓度IC5(I。
[0068] 细胞存活率（％)=加药孔的实际OD值/阴性对照孔的OD值；
[0069] 细胞抑制率（％)= 100% -细胞存活率；
[0070] 用MTT方法研宄L - TNSBCu和D - TNSBCu抑制不同细胞增殖的能力。所选的细 胞有人胃癌细胞（MGC803)、人肝癌细胞（HepG2)，人宫颈癌细胞（HeLa)，人胰腺癌细胞 (Canpan-2)，人肺癌细胞（A549)、人脐静脉内皮细胞（HUVECs)。从表1中分析，L - TNSBCu 和D - TNSBCu对测试细胞MGC803, Canpan-2和A549R的毒性有显著的手性选择性，即L -TNSBCu比D - TNSBCu的毒性大，对HeLa细胞有一定的程度的手性选择性，而对H印G2细胞 与血管内皮细胞没有显著的手性选择性。特别值得注意的是，L - TNSBCu和D - TNSBCu都 对HUVECs细胞有着显著的抑制增殖的作用，而HUVECs细胞在肿瘤血管的生成扮演着重要 的角色，这说明L - TNSBCu和D - TNSBCu对它们的抑制作用会对血管的生成有着很大的影 响。因此，本发明所述的L - TNSBCu和D - TNSBCu都具有显著地抑制所测肿瘤细胞增殖的 能力，以及对血管内皮细胞也具有很强的抑制增殖作用。
[0071] 表1. L - TNSBCu 和 D - TNSBCu 对肿瘤细胞的 IC5tl值
[0072]
[0073] 实施例9鼠动脉微管的生成抑制实验
[0074] 实验方法如下：
[0075] (1)将高浓度的基质胶用ECGM培养基（另增补含20ng/mL的VEGF)稀释一倍，然 后再预冷的96孔板的微孔中铺入60 μ L稀释的基质胶，在37°C孵育固化25分钟（注意避 开CO2通气孔）。
[0076] (2)在无菌条件下，把SD大鼠的胸动脉于无血清的ECGM培养基中，将外周脂肪和 结缔组织被剔除干净，裁切成段I. 0~2. 0_，轻放入基质胶中。
[0077] (3)再用60 μ L稀释的基质胶覆盖住胸动脉环，在37°C孵育固化25分钟；
[0078] (4)加入ECGM培养基100 μ L，每样品加入VEGF使浓度为40ng/mL，同时在药物组 中分别加入L-TNSBCu2. 0 μ M和L-TNSBCu/VEGF-siRNA2. 0 μ M，在培养中培养，每2天更换一 次相同成分的培养液。第4d，于倒置显微镜4Χ物镜下进行拍照，记录分析。
[0079] 实验的结果如图5所示，第4d观察到，VEGF(40ng/mL)组已经显著地出现大量的微 管，呈现一个快速生长趋势，相对于VEGF组，药物组[VEGF (40ng/mL)+L-TNSBCu (2. 0 μ M)] 处理过的动脉环，微管的生成量显然比VEGF组的少很多，而药物组[VEGFF(40ng/ mL)+2. 0 μΜ L-TNSBCu/VEGF-siRNA]处理过的动脉环，比L-TNSBCu处理过的动脉环更为显 著地抑制了微管的生成，这表明了载体L-TNSBCu自身有显著地抑制血管新生的作用，而且 当它负载了 VEGF-siRNA后，由于VEGF-siRNA对VEGF基因的沉默效应，抑制了 VEGF的表达， 使之L-TNSBCu与VEGF-siRNA产生了协同作用，增强了 L-TNSBCu抑制血管新生的作用。
【主权项】
1?一种手性四核铜基有机金属框架，其特征在于，其结构式为[Cu4(C17H16N03Br)2 (C17H17 N03Br)2(H20)2]2(N03)4.3(H20)，分子量为 3784. 25 ;其中C17H16N03Br和C17H17N03Br是阴离子配 体；所述的手性四核铜基有机金属框架以晶体形式存在，归属于单斜晶系，C2空间群。2. 根据权利要求1所述的手性四核铜基有机金属框架，其特征在于，所述的结构式为 L- [Cu4 (C17H16N03Br) 2 (C17H17N03Br) 2 (H20) 2] 2 (N03) 4 ? 3 (H20)或D- [Cu4 (C17H16N03Br) 2 (C17H17N03B r) 2 (H20) 2] 2 (N03) 4 ? 3 (H20);其中L- [Cu4 (C17H16N03Br) ^ (C17H17N03Br) ^ (H20) 2] 2 (N03) 4 ? 3 (H20)的 晶体结构归属于单斜晶系，C2空间群i= 18.3718A，c=18.5083A,，0 = 108. 740。；r=7982.7A3,Z= 2 ;D-[Cu4(C17H16N03Br)2(C17H17N03Br)2(H20)2]2(N03)4 ? 3(H20) 的晶体结构归属于单斜晶系，C2空间群，a= 24.8501A，= 18.4141A，c= 18.5435A,， 0 = 108.747° ;F=8035.2A3,Z= 2。3. 权利要求1或2所述的手性四核铜基有机金属框架的制备方法，其特征在于，包含如 下步骤：51. 将苯丙氨醇和强碱混合，加入有机溶剂搅拌溶解，然后加入5-溴-2-羟基-3-甲氧 基苯甲醛，恒温搅拌1~4h，停止反应，得配体SB，S卩Na2(C17H16N03Br)和Na(C17H17N03Br);52. 将配体SB和可溶性铜盐混合，溶于乙醇中，再加入多吡啶，恒温反应8~24h，反应 结束后得手性四核铜基有机金属框架。4. 根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，将得到的手性四核铜基有机金属框 架溶于水或乙醇水溶液中，得纳米级手性四核铜基有机金属框架。5. 根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，S1.中所述的苯丙氨醇、强碱和 5_溴-2-羟基-3-甲氧基苯甲醛的摩尔比为1~2 :1~3 :1~2 ;S1.中所述的苯丙氨醇 为L-苯丙氨醇、D-苯丙氨醇或非拆分手性的苯丙氨醇。6. 根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，S2.中所述的配体SB、可溶性铜盐和 多吡啶的摩尔比为1~3 :2~6 :1~2。7. 根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，S2.中所述的铜盐为硝酸铜；所述的 多吡啶优选为邻菲罗啉、联吡啶，或不加多吡啶。8. 权利要求1或2所述的手性四核铜基有机金属框架在制备抗肿瘤药物中的应用。9. 权利要求1或2所述的手性四核铜基有机金属框架作为肿瘤血管生成抑制剂的应 用。10. 权利要求1或2所述的手性四核铜基有机金属框架作为抗肿瘤药物或基因载体的 应用。
【专利摘要】本发明涉及金属有机材料制备技术领域，具体公开了一种手性四核铜基有机金属框架及其制备方法和应用。所述的手性四核铜基有机金属框架其结构式为[Cu4(C17H16NO3Br)2(C17H17NO3Br)2(H2O)2]2(NO3)4·3(H2O)，其中C17H16NO3Br和C17H17NO3Br是阴离子配体。其既是抗肿瘤药物的候选，又是良好的非病毒基因载体，是一种新型的多功能抗肿瘤药物的候选。
【IPC分类】A61K31/30, C07F1/08, A61P35/00, C12N15/87
【公开号】CN104910196
【申请号】CN201510272482
【发明人】刘杰, 秦秀英
【申请人】暨南大学
【公开日】2015年9月16日
【申请日】2015年5月25日