ipteran insect Nilaparvatalugens. PLoS One 6 (5),e20504.
【发明内容】
[0019] 本发明的目的在于针对目前技术的不足，提供一种褐飞虱CA基因片段及其dsRNA 和dsRNA在致死害虫中的应用。
[0020] 本发明所述的褐飞虱CA基因，其特征在于含有SEQ ID No. 1所示的核苷酸序列。
[0021] 所述的褐飞虱CA基因的dsRNA，其特征在于含有SEQ ID No. 2所示的核苷酸序列。
[0022] 所述的褐飞虱CA基因在控制褐飞虱存活率中的应用。
[0023] 所述的褐飞虱CA基因在控制褐飞虱繁殖力中的应用。
[0024] 所述的褐飞虱CA基因在水稻抗褐飞虱育种中的应用。
[0025] 本发明的目的可通过如下技术方案实现：首先，克隆褐飞虱致死基因片段CA，其 核苷酸序列如SEQ ID NO :1所示，并对序列进行测序验证；以已测序验证的CA基因片段序 列为模板合成dsRNA，其序列如SEQ ID NO :2所示。然后对褐飞虱CA基因沉默效果进行检 测。进一步将该基因转入水稻中，研宄转基因水稻对褐飞虱的生物学影响。
[0026] 克隆本发明中所述的褐飞虱基因 CA的方法是本领域中所常采用的方法。本发明 中所述的提取褐飞虱若虫总RNA、合成cDNA第一条链、合成dsRNA、实时荧光定量RT-PCR、褐 飞虱dsRNA饲喂、载体构建、转基因等方法都是本领域成熟的技术，试剂盒RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit(Fermentas)、AxyPrep DNA 凝胶回收试剂盒、MEGAscript'l<〕 T7Kit(ambi〇n)试剂盒等都可以从生产商家购买。
[0027] 本发明的优点在于：
[0028] 1、本发明是国内外首次公开褐飞虱CA基因核苷酸序列。目前关于其抑制表达并 可显著影响褐飞虱生长发育的功能未见相关报道。
[0029] 2、将dsRNA伺喂褐飞風后，可尚效的?几默了褐飞風的CA基因。褐飞風取食CA基 因 dsRNA后其靶标基因 mRNA水平显著降低。不仅在高浓度（0. 5 μ g/ μ 1)时可沉默该基因 并对褐飞虱产生更显著的致死效果，在较低浓度（0.1 μ g/μ 1)也可沉默该基因并对褐飞 虱产生明显的致死效果。说明利用褐飞虱CA基因可以控制褐飞虱存活率。
[0030] 3、转基因水稻CA对褐飞虱的若虫发育历期、世代周期、寿命及繁殖力等产生显著 影响，最终达到防治的效果。表明褐飞虱CA基因可以控制褐飞虱繁殖力，且该基因的利用 对水稻抗虫育种，特别是对水稻的抗褐飞虱育种起着重要的促进作用。
[0031] 为此本发明为无公害、可持续防治褐飞虱提供了新的有效途径，且CA基因 dsRNA 具有广阔的应用前景。可利用CA的沉默技术来防治水稻重要害虫褐飞虱及具有相似结构 域的半翅目害虫，为绿色防治水稻害虫提供了一个新的思路和技术。
【附图说明】
[0032] 图 I CA 基因目的片段 PCR 扩增，M :GeneRuler Ikb DNA Ladder ;泳道 1-2 :CA 基 因片段的PCR产物；
[0033] 图 2 对照基因 GFP 片段 PCR 扩增，M :GeneRuler Ikb DNA Ladder ;泳道 1-2 :GFP 基因片段的PCR产物；
[0034] 图 3 CA 基因目的片段 dsRNA 的制备，M :GeneRuler Ikb DNA Ladder ;泳道 I :CA 基因片段的dsRNA ;
[0035] 图 4 dsRNA 的制备，M :GeneRuler Ikb DNA Ladder ;泳道 I :GFP 的 dsRNA ;
[0036] 图5人工饲料饲喂褐飞虱流程图，1 :添加人工饲料；2 :密封试管一段；3 :接入褐 飞虱并密封试管另一端；4 :生测；
[0037] 图6饲喂CA基因的dsRNA后褐飞虱的存活率
[0038] ck ：0. 5 μ g/ μ IdsGFP ；Α ：0. 5 μ g/ μ IdsCA ；Β ：0. 1 μ g/ μ IdsCA ；C ：0. 02 μ g/ μ IdsCA ;*Means significantly different from control at P〈0.05.林Means significantly different from control at P<0. 01 (t-test).
[0039] 图7饲喂CA基因的dsRNA对褐飞虱mRNA表达水平的影响
[0040] ck ：0. 5 μ g/ μ IdsGFP ；Α ：0. 5 μ g/ μ IdsCA ；Β ：0. 1 μ g/ μ IdsCA ；C ：0. 02 μ g/ μ IdsCA ;*Means significantly different from control at P〈0.05.林Means significantly different from control at P<0. 01 (t-test).
[0041] 图 8 转基因水稻品系 A-73 的转化载体 1300-Ubi35s-G10-Ubi-RNAi-CA 的 T-DNA 区域结构示意图；
[0042] 图9转基因水稻CA的dsRNA检测1-10 :转基因水稻材料；-:受体材料秀水134为 阴性对照。
【具体实施方式】
[0043] 下面结合附图对本发明的技术方案作进一步的说明，但并不局限于此，凡是对本 发明技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，均应涵盖 在本发明的保护范围中。
[0044] 实施例1. CA基因片段的克隆方法：
[0045] (1)取褐飞虱各龄若虫共50头，用Trziol法提取总RNA。
[0046] 1)放入用液氮已预冷的无 RNase的研钵中，加入液氮迅速研磨，研磨至粉末状迅 速转移到预冷的2ml离心管中。
[0047] 2)加入1ml Trizol，上下颠倒轻柔混合均勾，室温下放置5min。
[0048] 3)加入Trizol 1/5体积（即200 μ 1)的氯仿，剧烈震荡20s，冰上放置3min。 4°C 12, OOOXg 离心 15min。
[0049] 4)将上层水相转移至另一 I. 5ml离心管，加入与水相等体积的异丙醇。将离心管 上下颠倒轻柔混合均勾，室温静置15min。4°C 12,000\8离心15111；[11。
[0050] 5)倒掉上清，加入1ml在冰上已预冷的75%乙醇至离心管中，洗涤提取的RNA，轻 弹管壁使RNA沉淀悬浮。4°C 7, 500 X g离心5min。
[0051] 6)倒掉上清，将离心管放入通风橱中干燥10min。
[0052] 7)加入50-100 μ I DEPC处理过的去离子水至离心管中，用枪头反复轻柔吹打至 RNA完全溶解。
[0053] (2)利用试剂盒RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit (Fermentas) cDNA 第一链的合成。
[0054] (3)根据对褐飞虱基因组数据库设计引物Pl和P2,以RT-PCR方法进行扩增。上 游引物（Pl)5'-ATGGTCGGATTCCACAACATGTTTCTGCACCC-3,（SEQ ID N0:3)
[0055] 下游引物（P2)5'-CTCACAAACACCTTCCTGTGTCC-3'（SEQ ID NO :4)反应体系如下：
[0056]
[0057]
[0058] 反应条件为
[0059]
[0060] (4)PCR产物经琼脂糖凝胶电泳分离，利用AxyPr印DNA凝胶回收试剂盒回收目标 DNA片段。
[0061] (5)将回收的目标片段与PMD18-T连接转化至TGl细胞中，挑取阳性克隆进行测 序。
[0062] (6)对已测序的序列在 http://blast. ncbi. nlm. nih. gov/Blast. cgi ? PROGRAM =blastx&PAGE_TYPE = BlastSearch&LINK_L OC = blasthome 进行同源性比对分析，预测 该序列为褐飞虱Carbonic Anhydrase(CA)基因的片段。CA基因片段序列如SEQ ID NO :1 所示。
[0063] 实施例2. dsRNA合成及回收
[0064] (1)根据已测序验证的CA基因片段序列，设计引物P3(SEQ ID N0:5)和P4(SEQ ID NO :6)，在上下游引物5'端加入T7启动子序列TAATACGACTCACTATAGGG。实施例1中测 序正确的PMD18-CA质粒为模板。设计带有T7启动子的引物P5(SEQ ID N0:7)和P6(SEQ ID NO :8)，以Pmdl8-GFP质粒为模板，扩增获得dsGFP的合成模板。
[0065] 上游引物（P3):
[0066] 5' -TAATACGACTCACTATAGGG ATGGTCGGATTCCACAACATGTTTC-3'
[0067] 下游引物（P4):
[0068] 5' -TAATACGACTCACTATAGGG CTCACAAACACCTTCCTGTGTCC-3'
[0069] 上游引物（