，因此将正交试验的乙醇浓度设为85%、90%和95%。
[0027] 3、浸提溫度对微藻油提取率的影响 选取90%乙醇作为提取剂，超声浸提溫度设定8个组，从30 °C到65 °C，梯度为5 °C， 料液比为1 : 10,超声浸提时间为30min,由图4试验结果可见，随溫度的上升，微藻油提 取率总体呈逐渐上升趋势，提取率差值在3%W内。当溫度达到50 后，提取率曲线趋于 平缓，在50 °C和65 °C时，提取率差值小于1%。考虑到溫度越高油脂越容易发生氧化，因此 将正交试验的=个溫度水平设为45 °C、50 °C和55 °C。
[0028] 4、浸提时间对微藻油提取率的影响 W90%乙醇为提取剂，溫度50°C，料液比1 : 10,超声时间（min),设W下8个提取时间 (min):2、4、6、8、10、30、60和120。结果（图5)显示，微藻油提取率总体上呈随时间延长 而提高的趋势。在2min到3 0min时，上升趋势明显；30min之后趋于平缓，各时间段的 提取率相差不到2%，变化不大，超声延长时间对藻油提取率的影响并不大，30min为最佳超 声浸提时间。
[0029]5、料液比对微藻油提取率的影响 W90%乙醇为提取剂，浸提溫度50 °C，超声浸提时间30min,设4个料液比：1:5、 1:10、1 : 15和1 : 20。结果（图6)表明，随着比值的升高，微藻油提取率总体呈上升趋 势。但在实际生产过程中，溶剂过多会造成浪费和生产成本增加，因此将正交试验的=个料 液比水平定为：1 : 5、1 : 10和1 : 15。
[0030] 6、提取次数对微藻油提取率的影响 对一次浸提后的剩渣作索氏抽提分析发现，剩渣中仍有微藻油残留。为此进行了增加 提取次数提高提取率的探索。在90%乙醇、料液比1 : 10、溫度为50 °C、浸提30min的条 件下，进行了提取1~4次的效果比较。结果（图7)显示，虽然藻油的提取率总体上随着提取 次数的增加呈增加趋势，但提取2次W后提取率增加幅度逐渐减小。考虑到提取次数多会 导致生产过程中溶剂损耗和生产成本增加，因此将正交试验提取的次数定为1次、2次和3 次。
[0031] 实施例二：EPA微藻油提取工艺的正交优化试验 根据^上单因素试验结果，选择乙醇浓度、提取溫度、料液比和提取次数，进行L9 (34^ 正交试验(表1 )。从正交试验结果(表2,表3)，影响微藻油提取率的因素依次为：提取次数 (D) >料液比（C) >提取溫度（B) >乙醇浓度（A)，统计结果达到极显著水平（P<0.0001)。 优化工艺组合为A2B2C3D3,即乙醇浓度90%，提取溫度50 °C，料液比1 : 15,提取3次。按照 此优化提取工艺条件进行验证，微藻油提取率为37.6%。
[0032] 表1正交试验因素水平
A:乙醇浓度；B:提取溫度；C:料液比；D:提取次数 表2正交试验结果与分析
A:乙醇浓度；B:提取溫度；C:料液比；D:提取次数 表3正交试验结果方差分析
A:乙醇浓度；B:提取溫度；C:料液比；D:提取次数 实施例S:EPA藻油脂肪酸的气相色谱检测 对提取的藻油W及原料藻粉进行气相色谱检测。检测步骤如下： ①采用=氣化棚法甲醋化分析脂肪酸：取2yL油脂加入=氣化棚甲醇溶液和正己烧 各1.5血，充入氮气，密封。在干式加热器中100 °C条件下加热60min,冷却至室溫。加入 1血双蒸水，摇匀1min，3000r/min条件下离屯、5分钟，将上层己烧相移到一个干净的试 管中，加入无水硫酸钢除去水分，移取溶液至干净试管，溶液用硅胶柱过滤。在氮气环境中 吹干该过滤液，加入100yL己烧再溶解。
[0033] ②气相色谱分析：用GC-14C型气相色谱仪测定脂肪酸，用N2010色谱数据工作站 采集图谱，并处理分析所采集的谱图数据。色谱峰采用混合的脂肪酸甲醋标样来进行鉴定。 定量方式采用面积法，定量方法为归一法。
[0034] ③谱图采集处理：采用与标准品保留时间对照的方法定性，即根据相对保留值定 性；采用面积法定量，即运用面积归一法求各色谱峰面积，并计算样品中的脂肪酸含量。
[0035] ④气相色谱分析条件：调节空气到50,调节氨气到75,调节Col(柱溫)到140 °C， 调节Det(检测器溫度）到270 °C，调节Aux(进样口溫度）到270°C。柱溫升溫程序：140 °C(1min);6 °C/min、170°C(3min);9 °C/min、220°C(18min);2 °C/min、230°C (2min)。
[0036] 气相色谱分析结果表明，微藻油中的主要脂肪酸成分是EPA(39. 0%)，此外，还含有 栋桐油酸、栋桐酸、油酸、肉豆違酸、亚油酸。具体成分含量见表4、图8。
[0037] 表4微藻油的脂肪酸组成 AA:花生四締酸；EPA:二十碳五締酸。
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【主权项】
1. 一种富含二十碳五烯酸拟微球藻油脂超声波辅助溶剂提取方法，其特征在于，包括 以下步骤： (1) 将破壁拟微球藻粉和提取溶剂混合； (2) 在水浴条件下超声浸提； (3) 超声结束后将料液分离； (4) 分离后的固体部分进行重新浸提或不进行重新浸提； (5 )分离后的液体部分进行溶剂回收即可得到藻油。2. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤（1)中的提取溶剂为体积比90%乙 醇，料液比为1:15 (g/mL)。3. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤（2)中水浴的温度为50°C，超声时 间为30min。4. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤（3)所述的料液分离采用离心或者 抽滤。5. 如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述步骤（3)离心转速为3000r/min。6. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤（4)中所述重新浸提的次数为两 次，总提取次数为三次。7. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤（5)中所述溶剂回收采用旋转蒸发 的方法，并且回收的乙醇可以重复利用。8. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤（5)中藻油的提取率多37%。9. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，进一步，所述步骤（5)取得到的藻油进行气 相色谱检测，测定其中主要脂肪酸组成，记录检测数据。10. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤（5)中藻油中含有的主要脂肪酸 有肉豆蔻酸、棕榈酸、棕榈油酸、油酸、亚油酸、花生四烯酸、二十碳五烯酸（EPA)，其中EPA 占总脂肪酸的质量百分比例彡39%。
【专利摘要】本发明公开了一种富含二十碳五烯酸拟微球藻油脂超声波辅助溶剂提取方法。首先配制90%乙醇作为提取溶剂，然后在优化工艺条件下进行油脂提取：温度50？℃，超声30？min，料液比1？:？15（g/mL），提取3次，最后将提取出的藻油和原材料破壁藻粉运用气相色谱仪测定脂肪酸组成。本发明建立的拟微球藻油提取优化工艺，油脂提取率可达37%以上，所得藻油主要成分二十碳五烯酸（EPA）占总脂肪酸的39%。该工艺流程简单，设备成本低，便于工厂化生产，其中乙醇在可在生产过程中回收利用，为工业化制取微藻油提供了重要的技术支持。
【IPC分类】C11B1/10
【公开号】CN105001982
【申请号】CN201510394831
【发明人】沈立荣, 翟量, 辛晓璇
【申请人】浙江大学
【公开日】2015年10月28日
【申请日】2015年7月8日