0082] I. 2. 4 miRNA 标记和纯化
[0083] 实验样品 RNA 采用 Agilent miRNA 芯片配套的试剂盒，miRNA Complete Labeling and Hyb Kit (Cat#5190_0456, Agilent technologies，Santa Clara, CA, US)，对样品中的 miRNA分子进行焚光标记。
[0084] 操作步骤如下：使用前稀释Spike-In溶液；Dephosphorylation去磷酸化；按如 下所示的顺序配制去磷酸化混合液：
[008
[0086] 取上述的混合液2 μ L至样本管中，总体积为4 μ L。混匀，离心，置于37°C金属浴 中孵育30min ;样本变性：在每管样本中添加2. 8 μ L 100% DMS0,置于100°C金属浴中孵育 7min ;连接：冰上，按如下所示配制连接反应混合液：
[0087]
[0088] 取4. 5 μ L反应混合液移至样本管中，总体积为11. 3 μ L，混勾，离心，16°C孵育2小 时；干燥样本：（I) 16°C孵育2小时反应结束后，需彻底干燥样本；（2) 45°C真空浓缩仪中抽 干3小时。
[0089] 1.2.5芯片杂交和洗涤
[0090] 按照Agilent miRNA芯片配套提供的标准操作流程和配套试剂盒，miRNA Complete Labeling and Hyb Kit(Cat#519〇-〇456,Agilent technologies,Santa Clara, CA, US)的杂交部分，进行样品的杂交实验。在滚动杂交炉中，Hybridization Oven (Cat#G2545A, Agilent technologies, Santa Clara, CA, US)，55°C，20rpm，滚动杂交 20 小时。杂交完成后在洗缸 staining dishes (Cat#121, Thermo Shandon, Waltham, MA, US) 中洗片，洗片所用的试剂为 Gene Expression Wash Buffer Kit (Cat#5188_5327, Agilent technologies, Santa Clara, CA, US)〇
[0091] 操作步骤如下：
[0092] 准备杂交样本
[0093] I、如下将抽干的样本重新溶解在22. 5 μ L混合液中；
[0094]
[0095] 2、每管中加入 22. 5 yL 2XHi-RPM Hybridization Buffer，轻微涡旋混匀；
[0096] 3、100°(：金属浴中孵育511^11;
[0097] 4、反应结束后，迅速将其转至冰水浴中冷却5min ;
[0098] 5、离心收集反应液并立即进行下面的步骤。
[0099] 准备杂交装置
[0100] 1、缓慢吸取45 μ L反应液至围栏中央；
[0101] 2、将芯片点样面（带有"Agilent"字样面）朝下缓慢放置在盖片上；
[0102] 3、将组装好的杂交仓放置在杂交炉的架子上，温度设定在55°C，转速为20rpm ;
[0103] 4、杂交20小时。
[0104] 芯片洗涤
[0105] 具体的洗涤时间和温度如下：
[0108] L 2. 6芯片扫描
[0109] 芯片结果米用 Agilent Microarray Scanner(Cat#G2565BA，Agilent technologies, Santa Clara, CA, US)进行 扫描， 用 Feature Extraction softwarel0.7(Agilent technologies, Santa Clara, CA, US)读取数据，最后米用 Gene Spring Software 11. 0 (Agilent technologies, Santa Clara, CA, US)进行归一化处理，所 用的算法为Quantile。
[oho] 具体设置扫描参数如下：
[0112] 1.2. 7芯片实验质控
[0113] 变异系数（CV值）是通过两组数据之间的比较分析来判断该体系是否是稳定的。 本芯片用重复探针点（10次重复）信号的CV值来计算芯片的稳定性和技术的稳定性。结 果显示，除个别样品外，大部分样品的CV值均控制在10%以内，结果可靠，可用于进一步分 析。
[0114] I. 3 miRNA表达谱芯片的分析与肾毒性生物标志物的确定
[0115] 1. 3. 1 差异 miRNA 的筛选
[0116] 米用 Gene Spring Software 11. 0 (Agilent technologies, Santa Clara, CA, US) 对每个时间点各组间进行主成分分析（Principle component analysis，PCA)，同时对组内 动物进行相关性分析等。组间差异miRNA的选择采用倍数变化（Fold changes，FC)大于2 或者小于0. 5且P〈0. 05。对所选的差异miRNA同时进行聚类分析。
[0117] miRNA可以结合在靶基因的3'UTR，下调靶基因。miRNA靶基因预测利用 TargetScan数据库、miRbase数据库、PicTar数据库、MirTarget 2. 0以及PITA数据库关 联microRNA的靶基因。由于不同数据库有很多相同的靶基因，因此本实验采用去除重复的 靶基因方法，留下合并的靶基因结果进行后续的分析。
[0118] 1.3.2 GO 分析
[0119] 对于预测的靶基因采用由上海生物芯片公司提供的在线SAS软件（http://Sas. ebioservice.)，基于 GO 的在线数据库（http://www. geneontology. org/)对 DEGs 进行生 物学过程的GO分类分析，包括DEGs的GO功能注释和GO功能富集分析。本研究中主要列 出的是生物学过程的分类。
[0120] miRNA-G0 Network利用革El基因的功能注释与miRNA-mRNA革El向调控关系，构建 miRNA功能调控的网络图。网络图可发现miRNA调控的多种基因功能，并通过网络分析，希 望得到核心调控miRNA以及miRNA调控的核心基因功能。
[0121] I. 3. 3 Pathway 分析
[0122] 对于预测的靶基因采用上海生物芯片公司提供的在线SAS软件对差异基因进行 生物学通路（Pathway)分析，Pathway分析主要包括革E基因的KEGG代谢通路、BioCarta 或细胞信号转导通路（Signal Pathway)Pathway富集分析图等，但在本文中主要列出了 KEGG (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，http://www. genome, adjp/kegg)的分 析结果。
[0123] 同时进行 miRNA - Pathway Network 的工作，miR-Pathway Network 与 miR-G0 Network类似，利用革El基因的Pathway间相互作用关系，与mi croRNA-mRNA革El向调控关系，构 建miR-Pathway调控的网络图。网络图可发现MicroRNA调控的多种信号通路，并通过网络 分析，得到核心调控microRNA以及microRNA调控的核心信号通路。
[0124] 1.3. 4芯片分析结果
[0125] L 3. 4.1 概述
[0126] 由表1可见，差异miRNA的选择标准不一，差异的miRNA数也有差别，但是整体的 趋势一致。本实验采用FC大于2或者小于0. 5且P〈0. 05,不同时间点动物差异miRNA基因， 给药1天后（D2)雌雄动物的差异miRNA数分别为9和8个，给药3天后（D4)雌雄动物的 差异miRNA数均为7个，给药7天后（D8)雌雄动物的差异miRNA数分别为28和9个，给药 14天后（D15)雌雄动物的差异miRNA数分别为44和51个，给药14天恢复28天后（R29) 雌雄动物的差异miRNA数分别为13和11个。可见差异的miRNA数也随着给药时间的增加 而增加，其中给药14天后的差异miRNA数量最多。而恢复28天后，差异miRNA数量接近给 药1天后的数量。进一步在P〈〇. 05的条件下，对D2、D4、D8和D15的肾脏差异miRNA进行 交集分析，雌雄动物的差异miRNA数分别发现7和8个。
[0127] 表1庆大霉素诱导肾损伤后对大鼠肾脏miRNA差异数
[0131] 2mean3表示FC大于2,且平均的信号值大于3。
[0132] L