3. 4. 2 GO 分析结果
[0133] 给予庆大霉素后，于02、04、08、015和1?29时间点取大鼠肾脏，并与阴性对照组比 较获得差异miRNA。差异miRNA的靶基因数非常多，对靶基因进行GO分析和KEGG通路分 析，可能注释到所有的功能和通路，因此集中对D4、D8和D15时间点进行交集，并对交集的 差异miRNA预测的靶基因进一步作GO分析和KEGG通路分析。
[0134] 表2庆大霉素诱导肾损伤后对大鼠肾脏差异miRNA预测的靶基因数
[0135]
[0136] 雌性动物各时间点交集的差异miRNA包括rno-miR-374,其调控的靶基因的核心 基因功能主要为氮磷化合物代谢、RNA代谢和转录、蛋白激酶调节、基因表达调控、胚胎生长 发育等（表3)。
[0137] 雄性动物各时间点交集的差异miRNA之一为rno-miR-374 (其核苷酸序列如序列 表中SEQ ID No. 1所示），其调控的靶基因的核心基因功能主要为氮磷化合物代谢、RNA代 谢和转录、蛋白激酶调节、胚胎生长发育、神经元发育分化等，可见雌雄动物的涉及到的主 要基因功能类似（表4)。
[0138] 表3雌性动物各时间点交集的靶基因 GO分析
[0139]
[0144] I. 3· 4· 3 Pathway 分析结果
[0145] 由表5可见，雌性大鼠交集miRNA的靶基因富集的生物学通路的改变，主要涉及癌 症信号通路，如前列腺癌、小细胞肺癌，黑素生成、细胞周期、朊病毒疾病、MARK信号通路等。
[0146] 由表6可见，雄性大鼠交集miRNA的靶基因富集的生物学通路的改变，主要也涉及 癌症信号通路，如前列腺癌、肾细胞癌、小细胞肺癌，黑素生成、细胞周期、吞噬作用、MARK、 p53、TGF-i3和T细胞受体信号通路、蛋白分解、白细胞移动等。可见雌雄动物的涉及到的 生物学通路类似。
[0147] 表5雌性动物各时间点交集的革El基因的Pathway分析
[0148]
[0149]
[0152]
[0153] 1.3.4.4 总结
[0154] 本实验肾组织的miRNA芯片结果显示，每个组动物的miRNA表达模式是相近的，每 组内样品的相关性比全基因表达检测结果稍差，可能是由于miRNA数较少有关。但是本实 验给药14天后（D15)的动物miRNA表达模式与阴性对照组动物的表达模式相差最远，其次 给药7天后（D8)的动物miRNA表达模式。差异miRNA数也随着给药时间的增加而增加，而 恢复28天后，差异miRNA数量接近给药1天后的数量，可见miRNA的改变与给予庆大霉素 损伤肾脏有关联。
[0155] 肾组织每个时间点差异miRNA的靶基因数非常多，但是对雌性动物各时间点交集 的差异miRNA之一为rno-miR-374,调控的靶基因的核心基因功能主要为氮磷化合物代谢、 RNA代谢和转录、蛋白激酶调节、基因表达调控、胚胎生长发育等。而雄性动物各时间点交集 的差异miRNA之一为rno-miR-374,调控的靶基因的核心基因功能与雌性动物类似。进一步 的通路分析显示，雌性主要涉及癌症信号通路，如前列腺癌、小细胞肺癌、黑素生成、细胞周 期、朊病毒疾病、MARK信号通路等。而雄性大鼠主要也涉及癌症信号通路，如前列腺癌、肾 细胞癌、小细胞肺癌、黑素生成、细胞周期、吞噬作用、MARK、p53、TGF-β和T细胞受体信号 通路、蛋白分解、白细胞移动等。可见雌雄动物涉及到的生物学通路类似。可见上述的差异 miRNA可以为检测肾毒性的新生物标志物，尤其是雌雄动物共有差异的rno-miR-374。
[0156] 实施例2检测肾损伤大鼠中血液中mo-miR-374的表达量
[0157] 取实施例1中，给药（80mg/kg，庆大霉素）7天后的大鼠三只和相同品种正常生长 的大鼠三只。分别抽取它们的总RNA，抽取方法与实施例1相同。
[0158] 将抽取的总RNA进行反转录获得cDNA(反转录试剂和体系参见miScript II RT kit，购自德国Qiagen公司）。其中，反转录的体系为每20 yL的反应溶液中含有4 yL的 5 X miScript HiFlex Buffer、2 μ L 的 10 X miScript Nucleics Mix、2 μ L 的 miScript Reverse Transcriptase Mix、余下为RNA模板和去RNA酶水。反转录的程序为：37°C，Ih ; 95°C，5min ;4°C，保温。
[0159] 然后通过qPCR检测mo-miR-374的表达量（qPCR试剂和体系参见ΚΑΡΑ SYBR'e FAST qPCR Kit，购自美国 Kapa Biosystems 公司）。其中，rn〇-miR-374 的引物为 rn〇-miR-374f (其核苷酸序列参见说明书序列表SEQ ID No. 2)。7900HT Sequence Detection System(购自美国 ABI 公司）上的 qPCR 程序为：95°C，2min ;94°C，15s ;60°C， lmin。从而实时检测样品中mo-miR-374的表达量。
[0160] 结果表明，采用实施例1中给药80mg/kg庆大霉素3天和14天后的大鼠与正常大 鼠相比，mo-miR-374的含量显著降低，给药3天后雌性动物是正常动物的mo-miR-374的含 量的0. 89倍，雄性动物是正常动物的1. 29倍；但是至给药14天后，雌性动物是正常动物的 mo-miR-374的含量的0. 35倍，而雄性动物是正常动物的0. 59倍。
[0161] 同时，病理诊断表明，实施例1中给药80mg/kg庆大霉素3天后的大鼠肾脏的轻微 损伤致14天后的明显产生了肾损伤。由此可知，mo-miR-374可以作为一种肾毒性生物标 志物检测外源性化合物引起的肾损伤。
[0162] 实施例3检测肾损伤大鼠中肾脏组织中mo-miR-374的表达量
[0163] 取实施例1中给药大鼠和正常大鼠的肾脏组织，分别抽取RNA、反转录获得cDNA、 通过qPCR检测肾脏组织中mo-miR-374的表达量（抽取RNA、反转录获得cDNA、通过qPCR 检测的方法与实施例2相同）。
[0164] 结果显示，实施例3与实施例2结果相似，说明mo-miR-374可以作为一种肾毒性 生物标志物检测外源性化合物引起的肾损伤。
[0165] 应理解，在阅读了本发明的上述内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种 改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
【主权项】
1. rno-miR-374在制备肾毒性生物标志物中的用途。2. 如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的肾毒性来源于外源性化合物引起的 肾损伤。3. 如权利要求1所述的用途，其特征在于，rno-miR-374作为唯一的肾毒性生物标志物 单独使用或者和常规的肾毒性生物标志物联合使用。4. 如权利要求3所述的用途，其特征在于，所述的常规的肾毒性生物标志物是血清肌 酐、尿素氮、尿总蛋白和/或丛生蛋白。5. -种检测外源性化合物引起的肾损伤的试剂盒，其特征在于，其包括特异性检测 mo-miR-374的引物，所述的引物为核苷酸序列如序列表中SEQ ID No. 2所示的DNA片段。6. 如权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，其还包括RNA抽提试剂、反转录试剂和/ 或qPCR试剂。7. 如权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述的RNA抽提试剂包括TRIZ0L。8. 如权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述的反转录试剂包括RNA逆转录酶。9. 如权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述的qPCR试剂包括DNA聚合酶。10. -种特异性检测mo-miR-374的引物，其特征在于，其是核苷酸序列如序列表中SEQ ID No. 2所示的DNA片段。
【专利摘要】本发明公开了一种mo-miR-374在制备肾毒性生物标志物中的用途及试剂盒和引物。mo-miR-374可以作为唯一的肾毒性生物标志物单独使用，也可以与常规的肾毒性生物标志物联合使用，并在检测外源性化合物引起的肾损伤中发挥作用。所述的试剂盒能够特异性强、可行性高地检测肾毒性生物标志物，从而检测外源性化合物引起的肾损伤。所述的引物能够特异性强地扩增mo-miR-374，并应用于所述的试剂盒中检测外源性化合物引起的肾损伤。
【IPC分类】C12N15/11, C12N15/113, C12Q1/68
【公开号】CN105018494
【申请号】CN201510405907
【发明人】邱云良, 马璟, 洪敏 , 富欣, 汤纳平, 李华, 黄欢夏
【申请人】上海益诺思生物技术有限公司
【公开日】2015年11月4日
【申请日】2015年7月10日