te Stimulator. ARTHRITIS&RHEUMATISM. Vol. 48, No. 11，November 2003, pp 3253 - 3265)。结果显示所筛选 的单克隆抗体可以阻断Blys与IM9细胞的结合（见图4)。
[0124] 参照上述实验方法，测定单克隆抗体和Belimumab (商品名Benlysta)的IC50值 即半数抑制浓度，结果表明（见图4下表），NMB04和NMB05,与Belimumab有相似的竞争抑 制活力。
[0125] 三、抑制Blys刺激的鼠脾细胞增殖
[0126] 将1:2系列稀释的不同抗体和Blys(终浓度3ng/ml)共同孵育2. 5h，加入到含 5000个鼠脾细胞的96孔板（购自corning)中，加入LPS(购自sigma，终浓度5 μ g/ml)进行 刺激，在培养箱培养72小时，用CellTiter-Glo (购自promega)检测细胞活性。采用Graph pad进行四参数非线性回归拟合，计算IC50。结果显示所筛选的单克隆抗体可以抑制Blys 刺激的鼠脾细胞增殖（见图5)，而且单克隆抗体NMB04的抑制活性优于Belimumab的活性， NMB04 的 IC50 值即半数抑制浓度为 0· 0062 μ g/ml,Belimumab 的 IC50 值为 0· 0082 μ g/ml。
[0127] 实施例5单克隆抗体的亲和力测定
[0128] 采用BIAcore T200测定单克隆抗体与Blys的亲合常数KD，首先，将羊抗人IgG固 定在CM5芯片上，以10 μ Ι/min加入10 μ g/ml的单克隆抗体，持续100秒，然后，以30 μ 1/ min流速加入300ηΜ的BLYS，持续300秒，观察解离情况，持续600秒。Biacore Τ200分析 软件，分析抗体的亲合常数KD，KD为kd/ka。结果显示（试验结果见图6)，ΝΜΒ04的亲合常 数 KD 为 7. 38Ε-10Μ，为 Belimumab 的两倍。
[0129] 实施例6单克隆抗体的体内活性测定
[0130] 抗Blys抗体通过结合Blys从而阻断其与受体的结合，来抑制Blys刺激的B细胞 增殖。体内活性包括，小鼠体内活性实验与食蟹猴体内药效的研究。
[0131] -、小鼠体内活性实验
[0132] 通过注射重组人Blys蛋白（购自义翘神州），刺激BALB/c小鼠脾B细胞的激活和 增殖，考察Blys抗体抑制脾B细胞的激活和增殖。第1天，给予BALB/c小鼠静脉注射5mg/kg 的抗体，1小时后，腹腔注射〇. 3mg/Kg重组人BLYS蛋白，第3天，重复第1天操作，第4-7天， 每天腹腔注射0. 3mg/Kg重组人BLYS蛋白，第8天，分离小鼠脾细胞，利用BD FACSCalibur 流式细胞仪检测成熟B细胞（B220+/ThB+)比例。
[0133] 结果如图7所示，与对照组相比，NMB04抗体显著抑制人BLYS诱导的体内脾B细 胞的激活和增殖。
[0134] 二、食蟹猴体内药效的研究
[0135] 选择检疫合格、体重相近的雄性食蟹猴6只，使用计算机系统，随机分成3组，分别 为对照组，Belimumab组和NMB04组，每组2只。缓慢静脉推注给药，0. 5-2mL/min，每只动物 恒定给药时间l〇min。给药频率及期限：每周给药一次，共给药4次，即Dl、D8、D15和D22 各给药一次。给药方式如下表3所示。
[0136] 表3试验方法
[0138] 末次给药后7天（D29)，所有动物非注射给药肢静脉取血，每只取血量约lmL。 EDTA-K2抗凝，利用BD FACSCalibur流式细胞仪测定血液中CD3+、CD3+/CD4+、CD20+及 ⑶21+占总淋巴细胞数的百分率。
[0139] 末次药后7天（D29)，所有动物安乐死后，取脾脏及肠系膜淋巴结，用眼科剪将脾 组织剪成0. 2~0. 3cm左右的小块，分离肠系膜淋巴结，分别置入尼龙筛网，用5mL注射器 活塞的橡胶头积压组织，使组织细胞通过筛网，台盼蓝拒染法测定细胞活力和细胞数。4°C、 800g、IOmin离心细胞并用PBS洗涤2~3次，重悬细胞至I. 0 X IO6个/mL左右。收集的单 细胞悬液在24h内测定。
[0140] 利用BD FACSCalibur流式细胞仪测定脾脏细胞悬液、肠系膜淋巴结淋巴细胞悬液 中⑶3+、⑶3+/⑶4+、⑶20+及⑶21+占总淋巴细胞数的百分率。
[0141] 试验结果见图8,动物给予相同剂量的NMB04和Belimumab，脾脏中⑶3+及⑶3+/ ⑶4+百分率未见明显变化，⑶20+及⑶21+的百分率略有下降。血液中⑶3+及⑶3+/⑶4+ 百分率未见明显变化，⑶20+及⑶21+的百分率有明显下降。肠系膜淋巴结中⑶3+及⑶3+/ ⑶4+百分率未见明显变化，⑶20+及⑶21+的百分率有明显下降。
[0142] 以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和 原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
[0143]
【主权项】
1. 一种抗Blys抗体的重链和轻链可变区，所述重链可变区的3个互补决定区氨基酸序 列分别为， CDR-Hl :TFGMN (SEQ ID NO. 1)； cdr-h2Jisx1Gsstiyyadtvkg(seqidno. 2)； CDR-H3 :LGDPLLRPKGNAMD (SEQ ID NO. 3)； 所述轻链可变区的3个互补决定区氨基酸序列分别为， CDR-Ll :LASQTIG X2X3LA (SEQ ID NO. 4)； CDR-L2 :AAT X4X5AD (SEQ ID NO. 5)； CDR-L3 :QQLYSSPWT (SEQ ID NO. 6)； 其中，父:是S或P ;X 2是T或K ;X 3是W或N ;X 4是S、K或R ;X 5是L、F、K或P。2. 根据权利要求1所述的重链和轻链可变区，其特征在于，所述抗Blys抗体的重链 和轻链可变区，还包含如（HC-FRl) - (CDR-Hl) - (HC-FR2) - (CDR-H2) - (HC-FR3) - (CDR-H3) - (H C-FR4)式所示在重链的互补决定区之间并置的可变重链框架区HC-FRl、HC-FR2、HC-FR3， 和 HC-FR4;以及如（LC-FRl)-(CDR-Ll)-(LC-FR2)-(CDR-L2)_(LC-FR3)-(CDR-L3)-(LC-FR4)式所示在轻链的互补决定区之间并置的可变轻链框架区LC-FRl、LC-FR2、LC-FR3,和 LC-FR4。3. 根据权利要求2所述的重链和轻链可变区，其特征在于，所述可变重链框架区和可 变轻链框架区来自于人胚系基因。4. 根据权利要求2-3任一权利要求所述的重链和轻链可变区，其特征在于，至少一个 所述可变重链框架区和/或至少一个所述可变轻链框架区的氨基酸序列如下所示： HC-FRl ：EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFS (SEQ ID NO. 7)； HC-FR2 ：WVRQAPGKGLEWVS (SEQ ID NO. 8)； HC-FR3 ：RFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAR (SEQ ID NO. 9)； HC-FR4 ：YWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO. 10)； LC-FRl ：DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC (SEQ ID NO. 11)； LC-FR2 ：WYQQKPGKAPKLLIY (SEQ ID NO. 12)； LC-FR3 ：GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC (SEQ ID NO. 13)； LC-FR4 ：FGGGTKVEIK (SEQ ID NO. 14)。5. -种抗Blys抗体，包含重链和轻链可变区，其重链可变区和轻链可变区分别与权利 要求1-4任一权利要求所述重链和轻链可变区具有至少90%的整体序列同一性。6. 根据权利要求5所述的抗Blys抗体，其特征在于，所述抗体的重链可变区的3个 互补决定区CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3其氨基酸序列分别与TFGMN、YISSGSSTIYYADTVKG和 LGDPLLRPKGNAMD具有至少90%的整体序列同一性；所述轻链可变区的3个互补决定区 CDR-Ll、CDR-L2、CDR-L3 其氨基酸序列分别与 LASQTIGTWLA、AATRKAD 和 QQLYSSPWT 具有至 少90%的整体序列同一1性。7. 根据权利要求6所述的抗Blys抗体，其特征在于，所述抗Blys抗体包含氨基酸序列 如SEQ ID NO. 18所示的重链可变区，以及氨基酸序列如SEQ ID NO. 19所示的轻链可变区。8. 根据权利要求7所述的抗Blys抗体，其特征在于，所述抗Blys抗体，包含： (a) -条重链，其氨基酸序列如SEQ ID NO :20所示； (b) -条轻链，其氨基酸序列如SEQ ID NO :21所示。9. 权利要求1-4任一权利要求所述抗Blys抗体的重链和轻链可变区，以及权利要求 5-8任一权利要求所述抗Blys抗体在制备治疗Blys相关性疾病的药物中的用途。10. 根据权利要求9所述的用途，其特征在于，所述Blys相关性疾病选自系统性红斑狼 疮、干燥综合征、类风湿关节炎、AIDS、白血病、癌症或淋巴瘤。11. 一种药用组合物，含有有效量的权利要求5-8任一权利要求所述抗Blys抗体。
【专利摘要】本发明涉及一种单克隆抗体，尤其涉及一种人B淋巴细胞刺激因子的单克隆抗体及含有该抗体的药物组合物，属于基因工程抗体技术领域。本发明的抗Blys抗体的重链可变区含有如SEQ？ID？NO:1、SEQ？ID？NO:2及SEQ？ID？NO:3的氨基酸序列，所述抗体的轻链可变区含有如SEQ？ID？NO:4、SEQ？ID？NO:5及SEQ？ID？NO:6的氨基酸序列。本发明的抗Blys单克隆抗体的抑制Blys与受体结合活性，与现有技术产物Belimumab的活性相似，但与BLYS的亲和力优于现有技术产物Belimumab，对Blys有更强的抑制作用，极具临床应用和市场前景。
【IPC分类】A61P35/02, A61P31/18, A61K39/395, A61P35/00, A61P37/02, C07K16/24, A61P19/02, A61P29/00
【公开号】CN105061596
【申请号】CN201510475493
【发明人】苏云鹏, 庄伟亮, 裴丽丽
【申请人】江苏诺迈博生物医药科技有限公司
【公开日】2015年11月18日
【申请日】2015年8月5日