-15%、蔗糖3%-10%、乳糖1%-2%、海藻糖 3% -10%〇
[0112] 5. 4方法
[0113]5. 4.1培养方法
[0114] 5. 4. 1. 1甘油种子活化取甘油保藏菌种接种到MRS液态试管中，（35°C-40°C)静 置培养10-15小时。
[0115] 5. 4. 1. 2种子培养按3% -6%的接种量，从活化菌液取适当量，接入装有150ml4# 液体培养基的250ml三角瓶中，（35°C-40°C)静置培养。
[0116] 5. 4. 1. 3发酵培养按3% -6%的接种量，接入装有培养基的10L发酵罐中，调节温 度 35°C-40°C、转速 50-100r/min、初始PH6. 0-7. 0 进行培养。
[0117] 5. 4. 1. 4终止发酵当菌生长15-24h后，将发酵罐降温到20°C左右，下罐。
[0118] 5. 4. 1. 5冷冻干燥4摄氏度4000-8000转离心5-10min，去上清，缓冲盐洗菌，4摄 氏度4000-8000转离心，去上清，收集菌泥，与保护剂按1:(3-6)混均进行冷冻干燥。
[0119] 5. 4. 1. 6冷冻干燥方法：将菌泥与保护剂混合均匀，按一定量装入冷阱预冻至零 下30-40°C，提出冷阱设定冷冻干燥参数进行干燥，参数如下：
[0120]
[0121] 5. 4. 1. 7喷雾干燥：4摄氏度4000-8000转离心5-10min，去上清，缓冲盐洗菌，4摄 氏度4000-8000转离心，去上清，收集菌泥，与保护剂按1 : (4-9)混均进行喷雾干燥。
[0122] 5. 4. 1. 8喷雾干燥方法：菌泥与保护剂混合均匀，仪器清洗灭菌预热，进风温度设 定150-170°C，出风温度为65-75°C，蠕动栗转速10-20,收集冷却产品。
[0123] 5. 4. 2测定方法
[0124] 5. 4. 2. 1活菌计数：采用稀释倾注平板计数法测定活菌数。
[0125] 5. 4. 2. 2存活率测定：乳杆菌存活率（％ )=(喷雾干燥后的活菌数/喷雾干燥前 的活菌数）X 100%
[0126] 5. 4. 2. 3水分含量测定：采用烘干方法测定产品水分含量，将装有2_3g样品的干 燥皿放入105°C的烘箱中加热，直至衡重，重复上述操作，直至两次连续称量质量之差不超 过0.0005g(GB/T 5413.8-1997)。
[0127]
[0128] ml :加入样品后干燥皿的初始质量，单位是g ;
[0129]m2 :样品烘干后两次称重获得的最小质量，单位是g;
[0130]m3:样品质量，单位是g。
[0131] 5. 4. 2. 4存活率测定：
[0132] 存活率（％ )=(喷雾或冻干后的活菌数/喷雾或冻干前的活菌数）X100%
[0133] 5. 4. 2. 5耐高温测定：取一定量喷雾粉置于烘箱中85 °C干热lOmin，测定其活菌 数。
[0134] 6?结果
[0135]
[0136] 罗伊氏乳杆菌耐酸耐胆盐实验
[0137] 1.实验方法
[0138] 1.1胆盐耐受试验
[0139] 罗伊氏乳杆菌LZ262用灭菌的改良MRS培养液37°C培养15h。将活化菌株培养 液以2%接种量接入含不同胆盐浓度的无菌改良MRS液体培养基中（胆盐浓度为0. 2%， 0.3%，0.5%，1.0%，1.6%)，同时以不含胆盐的改良MRS培养液为对照。在37°C培养0h、 2h、4h、6h、24h后取样测定活菌数。
[0140] 2. 2酸耐受性试验
[0141] 罗伊氏乳杆菌LZ262用无菌改良MRS培养液37°C培养15h，将活化的培养液以2% 的接种量接入不同PH值的无菌改良MRS中（PH分别为1. 3, 2. 0, 3. 0)，同时以PH6. 5的培养 液为对照。37°C培养，分别于0min，30min，60min，90min，120min.取样测定活菌。
[0142] 3?实验结果
[0143] 3. 1耐胆盐实验结果
[0144] 罗伊氏乳杆菌LZ262对不同胆盐浓度的耐受性见表3,胆盐浓度小于等于0. 3%时 对其无抑制作用，6h内活菌数不断增加，在0. 5% -1. 6%的胆盐浓度中生长具有一定的耐 受性。
[0145] 表3罗伊氏乳杆菌LZ262对不同浓度胆盐的耐受性
[0146]
[0147]
[0148] 3. 2耐酸实验结果
[0149] 罗伊氏乳杆菌LZ262在不同的酸性培养液中活菌数变化见表4,在PH2. 0条件下， 培养2小时仍有大量活菌存在，说明该菌株对酸有很强的耐受性。
[0150] 表4罗伊氏乳杆菌LZ262对酸的耐受性
[0151]
[0152]小结
[0153] 本实验分离得到的罗伊氏乳杆菌LZ262对酸、胆盐及室温都有很好的耐受性。人 的胃内PH值在2-3之间，吃酸性食物后PH值最低可达1. 5。罗伊氏乳杆菌LZ262在PH= 2和PH= 1. 3的酸性环境中可存活2个小时，仅下降了一个数量级；而在PH= 3的酸性 条件下，2个小时后活菌数的数量级没有发生变化。而食物（尤其是流体）通过胃的时间相 对较短，一般1~2h后便进入小肠。所以，罗伊氏乳杆菌LZ262的耐酸性可以保证其有相 当数量的活菌通过胃到达肠道。
[0154] 人体小肠的胆盐浓度在0. 03-0. 3%之间，本实验中胆盐浓度小于0. 3%时对罗伊 氏乳杆菌LZ262没有抑制作用，6h内活菌数不断增加。罗伊氏乳杆菌LZ262对胆盐有很强 的耐受性，可以通过小肠到达大肠。
[0155] 罗伊氏乳杆菌LZ262对大肠杆菌、乳酸菌的生物拮抗性
[0156] 1?材料与方法
[0157] 1. 1菌种
[0158] 罗伊氏乳杆菌LZ262,大肠杆菌，嗜酸乳杆菌，干酪乳杆菌，乳酸链球菌，德氏乳杆 菌保加利亚种，短双歧杆菌，青春双歧杆菌，两歧双歧杆菌均来自于本实验室。
[0159] 1.2培养基
[0160] MRS液体和固体培养基，番茄汁固体和液体培养基，营养肉汤固体和液体培养基
[0161] 1.3菌种活化
[0162] 罗伊氏乳杆菌活化：将置于低温冰柜的罗伊氏乳杆菌放到40~50°C水浴中解冻， 在无菌条件下，吸取0. 2ml接种到MRS液体培养基中，37°C恒温培养12~14h，活化2~3 代。
[0163] 乳酸菌的活化：同罗伊氏乳杆菌，乳酸杆菌采用MRS液体培养基活化，乳酸链球菌 采用番茄汁培养基活化。
[0164] 大肠杆菌的活化：将置于冰箱内的大肠杆菌按照2%的接种量转接到液体营养肉 汤培养基中，37 °C恒温培养12h，活化两代。
[0165] 1.4涂布营养琼脂平皿
[0166] 将活化好的大肠杆菌用涂布法均匀的涂布到营养琼脂平板上，要求涂布时的活菌 量在106cfu/ml。
[0167] 1.5倾注法培养乳酸菌
[0168]将活化好的乳酸杆菌和乳酸链球菌分别用倾注法均匀的铺在MRS平板上和番茄 汁固体平板上，要求涂布时的活菌量在l〇6cfu/ml。
[0169] 1. 6罗伊氏乳杆菌发酵液的制备
[0170] 将活化好的罗伊氏乳杆菌发酵液采用低温离心的方法，制备发酵上清液，离心条 件为 ：4°C，5000-8000rpm，5-10min。
[0171] 1. 7罗伊氏乳杆菌发酵液抑菌效果观察
[0172] 牛津杯法：将铺好的指示菌的营养琼脂平板、MRS固体平板和番茄汁固体平板自 然干燥30min，再在无菌条件下将牛津杯（内径为6mm)均匀放置于平板上，稍微下压，使其 与平板培养基接触面无空隙，然后吸取〇. 2ml发酵上清液于杯中，37°C恒温培养24h，观察 抑菌圈的大小，并测定抑菌圈直径。每个样品做三个平行，结果取平均值。对照组在牛津杯 中添加MRS液体培养基0. 2ml，培养条件相同。
[0173] 1.8实验结果
[0174] 结果表明，大部分乳杆菌对大肠杆菌都有抑制作用，且本发明所述的罗伊氏乳杆 菌抑菌效果尤为明显，具体结果见表5。
[0175] 实验表明，本发明所属的罗伊氏乳杆菌和大部分乳酸菌都能协同生长，这扩大了 罗伊氏乳杆菌的应用范围，具体结果见表6。
[0176] 表5乳酸菌与大肠杆菌的诘抗试验
[0177]
[0178] 表6罗伊氏乳杆菌与乳酸菌的复配性（拮抗试验）
[0179]
[0180] 罗伊氏乳杆菌LZ262用于制备饲料添加剂的方法如下：
[0181] 本发明的罗伊氏乳杆菌LZ262益生作用明显，可以和其他益生菌组配，用于动物 饲料中。试验表明，复合益生菌制剂能有效免受大肠杆菌的攻毒，提高对大肠杆菌的抵抗 力。各益生菌之间的比例为：罗伊氏乳杆菌LZ262:嗜酸乳酸杆菌：干酪乳杆菌：植物乳杆 菌=(1~2):(3~5):(2~3) : (1~2)。
[0182] 罗伊氏乳杆菌LZ262较强的产蛋白酶能力