fer，0.5yl RNaseInhibitor，2yl dNTP mix，0. 5 y 1反转录酶，轻轻混匀，在55°C放置30min后，转为85°C反应5min，4°C终止反应。
[0024] 1. 2同源克隆技术获得穿心莲香叶基香叶基焦磷酸合成酶基因核心区段
[0025] 进行两轮PCR扩增，反应总体积20.0yl，包括cDNA产物1.0yl，10XEx Taq buffer 2.0yl，dNTP mix(10mM)1.6yl，上下游引物（第 1 轮为 GGPS-F2 和GGPS-R2,第 2 轮为GGPS-F1和GGPS-R1。扩增保守区段的两对嵌套引物为GGPS-F1和GGPS-R1、GGPS-F2 和GGPS-R2,引物序列组成见文献"丹参栊牛儿基栊牛儿基焦磷酸合酶基因的克隆与分 析"）（10 y M)各 5 y l，ExTaq 0? 3 y 1 和 5. 1 y 1 ddH20。第 1 轮 PCR 扩增条件为 95°C 5min ; 94°C lmin，30°C 3min，72°C lmin，20cycles ;72°C lOmin。第 2 轮 PCR扩增条件为 95°C 5min ; 94°C lmin，30°C 3min，72°C 50s，35cycles ;72°C lOmin。反应结束后，用 1%琼脂糖凝胶电 泳检测产物。切胶回收清晰的条带后，送公司测序。
[0026] 1. 3反转录获得cDNA
[0027] 按照TaKaRa公司SMARTer? RACE cDNA扩增试剂盒说明书，制备5' RACE cDNA和 3' RACE cDNA，分别用于5' RACE和3' RACE反应。在配制反转录体系时，根据文献（参考 文献A guide for in-house design of template-switch-based5r rapid amplification of cDNA ends systems)，使用了海藻糖（trehalose)和甜菜喊（betaine)。
[0028] 1.4配制引物工作液
[0029] UPM引物需要配制成10 X混合液。先把UPM Long和UPM Short引物稀释成10 y M 浓度，取UPM Long引物4yL，UPM Short引物20yL，最后加入76yL灭菌水，混合即成 10XUPM引物工作液。其他引物均配制成10yM工作液。
[0030] 1.5 3'RACE反应：
[0031] 采用巢式PCR扩增3'端序列。在第1轮扩增反应中，首先配制总体积为 41. 5 y 1 的 Master mix，由 34. 5 y 1 ddH20、5. 0 y 1 10 XAdvantage 2PCR buffer、 1.0 y 1 50XAdvantage 2polymerase mix 组成。然后在 Master mix 中分别加入 2.5 yl 3 r RACE cDNA和5.0y 1 10XUPM引物，使得总体积达到50.0y 1。PCR扩增条件为 94°C 30s，72°C 3min，5cycles ;94°C 30s，70°C 30s，72°C 3min，5cycles ;94°C 30s，68°C 30s， 72°C 3min，25cycles ;72°C 10min。将第 1 轮 PCR 产物用 TE稀释 50 倍，取 2. 5y 1 用作模 板，分别加入41. 5 y 1 Master mix，1. 0 y 1 5' Primer II A 引物（10 y M)和 AP-GGPS-3' 引 物（10 y M)，总体积 50. 0 y 1，进行第 2 轮 PCR。扩增条件为 94°C 30s ;68°C 30s，72°C 3min， 20cycles ；72〇C 10min〇
[0032] 反应结束后，用1%琼脂糖凝胶电泳检测产物。切胶回收清晰的条带后，进行TA克 隆，筛选阳性单克隆后测序。
[0033] 5'RACE反应：
[0034] 使用TaKaRa Tks Gf lex DNA Polymerase进行两轮巢式PCR扩增。第一轮扩增的 反应总体积为 50. 0 y 1，包括 2. 5 y 1 5 ' RACE cDNA，25. 0 y 1 2 X Gf lex PCR buffer (Mg2+， dNTP plus)，1.0yl Tks Gflex DNA Polymerase (1.25units/yl)，0. 5yl 10 XUPM 引物， 1. 0 y 1 CTG0074R1引物（10 yM)和15. 5 y 1 ddH20 ;第二轮扩增的反应总体积为50. 0 y 1， 包括 l.Oyl 第 1 轮PCR 反应液，25.0yl 2XGflex PCR buffer(Mg2+，dNTP plus)， 1. 0 y 1 Tks Gflex DNA Polymerase (1. 25units/y 1),1. 0 y 1 5r PCR Primer II A 引物 和 CTG0074R2 引物（10 yM)，21. 0 y 1 ddH20。两轮 PCR 扩增条件均为 94°C lmin ;98°C 10s， 55〇C 15s,68〇C lmin，30cycles〇
[0035] 反应结束后，用1%琼脂糖凝胶电泳检测产物。切胶回收清晰的条带后，进行TA克 隆，筛选阳性单克隆后测序。
[0036] 1.6全长基因的拼接、扩增
[0037] 利用CodonCodeAligner软件进行序列拼接。根据拼接后的序列，设计两侧引物， 从穿心莲cDNA中进行全长序列的扩增。用1%琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物。切胶回收清 晰的条带后，进行TA克隆，筛选阳性单克隆后测序。
[0038] 1. 7香叶基香叶基焦磷酸合成酶基因原核表达质粒的构建
[0039] 利用引物pAD12-GGPS-F和pAD12-GGPS-R，从阳性单克隆中扩增ApGGPS基因的开 放阅读框。上游引物的5'端引入了 Sac I酶切位点（GAGCTC)，下游引物的5'端引入了 Spe I 酶切位点（ACTAGT)。PCR 扩增条件为 94°C 3min ;94°C 30s, 63°C 30min, 72°C 2min， 33cycles ;72°C 10min。反应结束后，用1%琼脂糖凝胶电泳检测产物，切胶回收略大于lkb 的条带。
[0040] 用限制性内切酶SacI和SpeI分别酶切回收的产物和PAD12原核表达质粒。用 PCR产物清洁试剂盒纯化回收的两种产物，用T4DNA连接酶进行连接。电击法将连接产物转 化到蛋白酶缺陷性大肠杆菌XLl-BlueMRF'(即TKX1)中。
[0041] 用PCR法鉴定阳性单克隆菌落，获得可表达香叶基香叶基焦磷酸合成酶的基因工 程菌。
[0042] 2结果与分析
[0043] 2. 1 总RNA提取
[0044] 利用无液氮法，提取获得了质量较好的穿心莲总RNA(图1)。
[0045] 2. 2保守区段扩增和RACE
[0046] 保守区段扩增后，经琼脂糖凝胶电泳检测产物，略小于500bp处有一条带。回收 后，直接进行测序，获得408bp保守区段。采用巢式PCR进行3' RACE扩增，在500bp左右 各有一条带；采用巢式PCR进行5' RACE扩增，在约lkb处有条带。根据RACE结果，利用 两侧引物进行扩增后，获得一条长1440bp的DNA序列如SEQN0:1，包含一个由1047个核苷 酸组成的香叶基香叶基焦磷酸合成酶基因的完整开放阅读框，编码一条由348个氨基酸组 成的蛋白质序列。
[0047] 2. 3获得可表达香叶基香叶基焦磷酸合成酶的基因工程菌
[0048] 本研究通过构建含有香叶基香叶基焦磷酸合成酶基因的重组大肠杆菌工程菌，保 存于LB培养基中，表达出的香叶基香叶基焦磷酸合成酶大小约为37kD，编码的氨基酸序列 如SEQN0:2。
【主权项】
1. 穿心莲香叶基香叶基焦磷酸合成酶基因，其具有如SEQ ID NO: 1所述序列。2. 权利要求1所述基因对应的蛋白质，其序列如SEQ ID N0:2。
【专利摘要】本发明属于生物技术领域，涉及穿心莲香叶基香叶基焦磷酸合成酶基因，具有SEQ？NO:1序列。本发明所提供的穿心莲香叶基香叶基焦磷酸合成酶基因可以用于在穿心莲中进行荧光定量表达、基因功能验证等研究；可以用于制备DNA探针；可以转入生物反应器，通过表达或抑制表达等方式生产相应的代谢成分。所提供的蛋白质序列及其原核表达菌可以用来生产香叶基香叶基焦磷酸合成酶或制备抗体。以上发明，对于穿心莲内酯相关产品的开发和利用具有重要的意义。
【IPC分类】C12N9/10, C12N15/54
【公开号】CN105063069
【申请号】CN201510552222
【发明人】王晓云, 钟国跃, 陈蓉
【申请人】江西中医药大学
【公开日】2015年11月18日
【申请日】2015年9月2日