备培养基：蛋白胨10g、牛肉膏10g、葡萄糖20g、酵母浸膏5g、吐温801ml、磷 酸氢二钾2g、柠檬酸三铵2g、乙酸钠5g、硫酸镁0. 5g、硫酸锰0. 2g、L-半胱氨酸0. 5g、硫乙 醇酸钠〇? 05g、VB120. 005g、甘油3. 68g加水定容至1L，调节pH值为6. 8;
[0038] 二、将本发明的罗伊氏乳杆菌RSOl接入步骤一中制备的培养基中，37°C厌氧发酵 5h；
[0039] 三、分离：第一次分离采用板框分离，收集菌体快速而且不易造成菌体死亡；然后 将分离的菌体接入新的培养基中，在37°C、溶氧量为0的条件下，培养4h;第二次分离采用 高速管式离心机，可以使目的产物与菌体有效分离；
[0040] 四、合并两次分离得到的发酵液。
[0041] 根据3-羟基丙醛在强酸条件下加热脱水形成丙烯醛，而色氨酸在浓盐酸的存在 下，与丙烯醛反应生成紫色物质，在560nm下有吸收峰。因此，通过显色反应来检测所得 3-羟基丙醛的产量。经测定，突变前的罗伊氏乳杆菌发酵产3-羟基丙醛的量几乎为0,采 用本申请中的罗伊氏乳杆菌RSOl结合上述发酵方法，所得3-羟基丙醛的产量为2. 5-2.Sg/ L;而菌种的生长周期由原来的12-20h缩短至现在的5h，大大降低了生产成本，节约了水、 电、汽等能源。
[0042] 抑菌试验
[0043] 将实施例1中分离得到的发酵液稀释到四倍体积，按照以下步骤对发酵液的抑/ 杀菌（白色念珠菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌）能力进行测定：
[0044] 一、配制培养基：配制营养琼脂培养基；
[0045] 二、灭菌：将步骤一配制的培养基、培养皿、牛津杯、移液枪枪头等放入灭菌锅中灭 菌；
[0046] 三、取适量活化好的致病菌接入冷却至40°C的培养基中，制得菌悬液；
[0047] 四、将步骤三中的菌悬液倒入培养皿中，待培养基凝固；
[0048] 五、在培养皿中放入牛津杯（每个平皿放3个），再于牛津杯中加入0.24ml待测样 品；
[0049] 六、将步骤五中的培养皿放入培养箱中培养12h;
[0050] 七、观察抑菌圈大小。
[0051] 抑菌效果根据抑菌圈大小来判断，标准如表1所示，所得结果见图3-5。
[0052] 表1抑菌效果判定标准
[0053]
[0054] 抑菌试验结果显示，本发明的发酵液抑制白色念珠菌所形成的抑菌圈直径为 26. 3_、抑制金黄色葡萄球菌所形成的抑菌圈直径为27. 8_、抑制大肠杆菌所形成的抑菌 圈直径为31. 2mm，结果均显著高于高度敏感的标准，采用以上方法验证稀释80倍体积的发 酵液的抑菌效果，发现发酵液稀释至80倍仍有抑菌效果，说明本发明的益生菌素高产菌株 的发酵液对白色念珠菌、金黄色葡萄球菌和大肠杆菌均有很强的杀灭作用。
[0055] 安全性试验
[0056] 为验证本发明益生菌素高产菌株的安全性，采用本发明的发酵液对SD系大鼠进 行灌胃，来研究本发明的益生菌素高产菌株代谢生产物对其血生化指标和口腔组织的影 响。
[0057] 取体重为200g±20g的雌性SD系大鼠40只，将其分为三组，阴性对照组10只，空 白对照组10只，实验组10只。实验组用ImL实施例1制得的提取液灌胃，1次M共21d。
[0058] 所得结果如下：
[0059] 1、实验组的血清丙氨酸氨基转移酶（ALT)、血清肌酐（CREA)、血清尿酸（uA)、血清 总蛋白（TP)、血清白蛋白（ALB)、血清球蛋白（GLOB)均不高于正常对照组的指标。
[0060] 2、组织检查结果为，肝肾组织石蜡切片，HE染色，显微镜观察，未见变形浸润、红 肿、炎症。
[0061] 药效实验
[0062] 为了验证本发明益生菌素高产菌株代谢产物对口腔真菌感染的治疗效果，实验对 象为60位年龄在18-50岁的口腔真菌感染患者。采用实施例1中制得的提取液稀释8倍 作为含漱药液，每次20mL，含漱药液5min，每日3次，连续8d。用药满7天和10天后进行 白假丝酵母菌、克柔氏念珠菌、光滑念珠菌及白色念珠菌等真菌培养检测，咽拭子培养阴性 (-)患者为有效，咽拭子培养阳性（+)患者为无效。
[0063] 截止第6d，真菌转阴率为63. 3%，第8d，真菌转阴率为76. 6%。具体见表2。
[0064] 表2 口腔感染的治疗效果
[0065]
[0066] 本发明益生菌素高产菌株代谢产物对口腔真菌具有较强的抑制作用，临床可以广 泛应用于口腔感染患者，同时本发明的益生菌素高产菌株代谢产物对小鼠的灌胃试验说明 其安全毒副作用和刺激性，因此可用于预防或治疗哺乳动物的口腔感染。
[0067] 以上所述的实施例仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范 围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方 案作出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。
【主权项】
1. 一株3-羟基丙醛高产菌株，其特征在于：其为罗伊氏乳杆菌RS01，保藏在中国微生 物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No. 9971，保藏日期为2014年11 月14日。2. 根据权利要求1所述的3-羟基丙醛高产菌株，其特征在于：所述罗伊氏乳杆菌RSOl 的细胞壁染色呈革兰氏阳性，无芽孢，菌体呈现短棒状，分布为单个或呈连接状。3. 根据权利要求1所述的3-羟基丙醛高产菌株，其特征在于：所述罗伊氏乳杆菌RSOl 菌体长 I. 5_3um、宽 0. 6-0. 9um。4. 根据权利要求1所述的3-羟基丙醛高产菌株，其特征在于：所述罗伊氏乳杆菌RSOl 的菌落光滑细腻，边缘整齐，菌落大小均匀一致，乳白色、湿润、不透明。5. -种利用权利要求1中所述罗伊氏乳杆菌RSOl生产3-羟基丙醛的方法，其特征在 于包括以下步骤： 一、 制备培养基：蛋白胨l〇g、牛肉膏l〇g、葡萄糖20g、酵母浸膏5g、吐温801ml、磷酸氢 二钾2g、柠檬酸三铵2g、乙酸钠5g、硫酸镁0. 5g、硫酸锰0. 2g、L-半胱氨酸0. 5g、硫乙醇酸 钠0? 05g、VB120. 005g、甘油3. 68g加水定容至1L，调节pH值为6. 8 ; 二、 将权利要求1所述罗伊氏乳杆菌RSOl接入步骤一中制备的培养基中，37°C、溶氧量 为〇的条件下，培养5h ; 三、 分离：第一次分离采用板框分离；然后将分离的菌体接入新的培养基中，37°C、溶 氧量为〇的条件下，培养4h ;第二次分离采用高速管式离心机； 四、 合并两次分离得到的发酵液。6. -种3-羟基丙醛高产菌株在防治哺乳动物口腔感染中的应用，其特征在于：用于制 备各种预防和治疗口腔感染的药物。
【专利摘要】本发明一株3-羟基丙醛高产菌株及其在防治哺乳动物口腔感染中的应用，涉及一种微生物及其组合物，特别是涉及一种用于防治哺乳动物口腔感染的微生物及其组合物。其目的是为了提供一种生长周期短、益生菌素产量高的罗伊氏乳杆菌，及其在防治哺乳动物口腔感染中的应用。本发明的3-羟基丙醛高产菌株为罗伊氏乳杆菌RS01，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC？No.9971，保藏日期为2014年11月14日。本发明的3-羟基丙醛高产菌株易于培养、目标产物产量高、其发酵液安全无毒副作用、具有广谱的抗菌作用。本发明用于防治哺乳动物口腔感染领域。CGMCC No.997120141114
【IPC分类】C12P7/24, A61P31/04, A61P31/10, A61P1/02, A61K35/747, C12R1/225, C12N1/20
【公开号】CN105087434
【申请号】CN201510498277
【发明人】吴前进
【申请人】吴前进
【公开日】2015年11月25日
【申请日】2015年8月13日