一种珠子参转录因子基因PjbHLH1的应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及分子生物学以及基因工程领域，尤其是一种珠子参皂苷生物合成转录因子基因pjbHLH:mm%。
【背景技术】
[0002]珠子参Parmx japonicus C.A.Mey.var.major (Burk.) C.Y.Wu et Κ.M.Feng为五加科Araliaceae人参属植物，因根莖节间纤细，节膨大成球形念珠状而得名，其根茎入药。珠子参作为药材，始载于《滇南本草》，为历版《中国药典》收载品种。药用珠子参主产于云南，属名贵常用中药材，是彝族、纳西族、白族、藏族、傈僳族等少数民族的传统用药。目前，野生珠子参主要分布于滇西北、滇东北地区，常见于海拔达2500-4000m的亚高山针叶林及阔叶林下。珠子参性味苦、甘、微寒，归肝、肺、胃经，具有补肺养阴、祛瘀止痛，止血之功效，临床上应用于气阴两虚，烦热口渴，虚痨咳嗽，跌打损伤，关节疼痛，咳血，吐血，外伤出血等。
[0003]珠子参阜苷{Panax japonicus saponins, PJS)为珠子参的主要活性成分，包括达玛烷型、齐墩果烷型三萜皂苷。目前，已从珠子参根茎及叶中分离出了 30多种皂苷成分，主要包括竹节参皂苷IVa、竹节参皂苷IV、竹节参皂苷V、人参皂苷Ro、人参皂苷Re、人参皂苷Rd、人参皂苷Rbl等。人参属的代表物种“人参”ginseng)主要含达玛烷型皂苷，齐墩果烷型皂苷仅发现含量极微的人参皂苷Ro ;另一种人参属著名药材“三七” {Panaxnotoginseng)，只含达玛烷型皂苷，不含齐墩果烷型皂苷。珠子参所含皂苷组分与同属“人参”、“三七”相比，在成分种类以及各组分含量上均存在明显差异，因其含有大量齐墩果烷型皂苷，导致临床上的特殊用途。
[0004]珠子参为多年生草本植物，需生长6年以上方能入药。目前，珠子参药材多为野生品，无序采挖导致珠子参资源日渐枯竭，生境受到破坏。近些年，以珠子参为组分的药品市场迅速扩大，导致珠子参药材需求增长，供需矛盾突出。鉴于人工栽培时间长，化学合成机理和路线不够清晰等弊端，利用生物工程技术和基因调控的方法来生产珠子参皂苷逐渐成为研究热点。
[0005]转录因子对基因的转录激活是植物次生代谢过程重要的调控环节。利用转录因子作为改造植物代谢途径的工具，以其独有的“多点调控”优势，弥补了代谢工程操作中单个关键酶基因作用不足和多个关键酶基因可能产生组成性致死表达的情况，成为一种新的策略。次生代谢途径中多个功能相关的酶基因常被同一转录因子正调控或负调控，对转录因子进行基因修饰显然比多基因操作更容易改良目标次生代谢途径。
[0006]含碱性/螺旋-环-螺旋结构(basic/helix-loop-helix，bHLH)的转录因子广泛存在于生物中，是真核生物中一类含有众多成员的重要转录因子。越来越多的研究表明该类转录因子对真核生物的次生代谢过程具有重要调控作用。例如青蒿UriMkiaapiacea ) AabHLHl转录因子可以提高青蒿素生物合成相关的紫穗槐4，11- 二稀合酶(ADS)和细胞色素P450单加氧酶(CYP71AV1)基因的表达量，正调控青蒿素的合成；红豆杉(Taxuschinensis)bHLH类转录因子TcJAMYC可与紫杉醇生物合成相关基因启动子的E_box结合，激活这些关键酶基因的表达，提高紫杉醇的合成量。
[0007]随着对植物次生代谢网络的深入解析和调控机制的阐明，特别是调节特定次生代谢物合成的转录因子的分离和鉴定，基于转录因子的基因工程将为开发利用植物次生代谢物提供更加有效的手段。本发明以体外培养的珠子参愈伤组织为研究对象，克隆PjbHLHl转录因子基因，并对该转录因子进行分析和功能鉴定，明确PjbHLHl转录因子在珠子参皂苷生物合成过程中的地位和作用，为获得高效、稳定的珠子参皂苷合成调控技术和同源或异源高效表达系统的建立提供理论参考和依据。
【发明内容】
[0008]本发明的目的是提供一种珠子参转录因子基因Pjbrnmmk，即珠子参转录因子基因在提高珠子参皂苷生物合成关键酶基因表达量和增加珠子参愈伤组织中皂苷含量中的应用；本发明从珠子参中克隆获得可调控珠子参皂苷生物合成的转录因子基因以及明确该转录因子的应用。
[0009]本发明基于同源克隆的原理，从珠子参中克隆得到bHLH类转录因子基因的cDNA并对其编码蛋白进行功能鉴定。发明人将这个基因命名为PjbHLHl,基因登录号为KP890785，其中所述cDNA如SEQ ID NO: I所示。对该基因进行序列分析，表明份cDNA大小为966 bp，正好为开放阅读框(Open reading frame，ORF)，编码含有321个氨基酸的蛋白质，氨基酸序列如SEQ ID NO: 2所示。利用植物表达载体，通过农杆菌介导法将本发明的转录因子基因导入珠子参愈伤组织中，可提高珠子参皂苷合成途径关键酶基因的表达量，使珠子参皂苷的产量增加。
[0010]上述转录因子基因可应用于正调控珠子参皂苷的生物合成，具体操作如下:
(1)基因的获得:提取珠子参总RNA，反转录合成cDNA第一链；通过RT-PCR扩增出/!/??份的全长编码区，然后将其连接到pGEM-T easy载体上，经测序验证获得具有目的基因的克隆；
(2)植物表达载体构建与遗传转化:用限制性内切酶ZAaI和Pstl酶切vGm-?-PjbHLHljmtL,通过胶回收获得目的基因片段。用同样的内切酶消化植物表达载体PCAMBIA2300S，胶回收获得载体大片段。将目的基因片段与pCAMBIA2300S载体片段连接，构建植物超表达载体pCAMBIA2300S-/^M￡份。通过液氮冻融法将pCAMBIA2300S_/^M￡份质粒导入农杆菌菌株EHA105中。利用农杆菌介导的遗传转化法，将PjbHLHl导M好參愈、伤组织中使其过量表达。通过抗生素筛选和qRT-PCR筛选阳性转基因细胞系；
(3 )转基因细胞系皂苷含量检测:提取珠子参转基因和非转基因细胞系中的皂苷，分析转基因和非转基因细胞系间皂苷含量的差异。
[0011]本发明为提高珠子参中皂苷的含量提供了一种新方法，利用生物工程技术和基因调控的方法可更高效率合成珠子参皂苷，克服了人工栽培周期长、化学合成机理和路线不够清晰等缺点。将转录因子基因导入珠子参细胞中表达，使珠子参皂苷生物合成途径关键酶基因的表达量提高，增加了珠子参皂苷的产量，为大规模产业化生产珠子参皂苷提供了理论参考和科学依据。
【附图说明】
[0012]图1为本发明中珠子参总RNA电泳图谱；
图2为本发明中/5JbHLHl RT-PCR检测结果，其中M为DL2000 DNA Marker，I为/5JbHLHl的RT-PCR产物；
图3为本发明中PjbHLHl的三维结构预测；
图4为本发明中qRT-PCR结果分析图，表示珠子参皂苷合成途径中受PjbHLHl调控的基因在野生型和转基因细胞系中的表达水平，其中C为野生型细胞系，1-3为转基因细胞系；
图5为本发明中珠子参皂苷的含量测定结果，其中C为野生型细胞系，1-3为转基因细胞系。
【具体实施方式】
[0013]下面通过附图和实施例对本发明进一步说明，但本发明保护范围不局限于所述内容，实施例中方法如无特殊说明均为常规方法，使用的试剂如无特殊说明均为常规市售试剂或按常规方法配制的试剂。
[0014]实施例1基因的克隆以及生物信息学分析
因珠子参中含有较多的次生代谢物质，需采用两步法进行总RNA的提取。先采用改良的异硫氰酸胍法取进行粗提，接着使用DNA酶进行消化并利用氯仿抽提得到较纯的珠子参总RNA(图1)。采用逆转录酶M-MLV (promega)以珠子参总RNA为模板合成cDNA第一链，反应体系和操作过程为:取5 yg Total RNA，依次加入50 ng oligo(dT) 15、2 μ L dNTP(2.5 mM each)、DEPC水至反应体积为13.5 μ L ;混匀后，70°C加热变性5 min后迅速在冰上冷却 5 min，然后依次加入 4 μ L 5 X First-stand buffer、0.5 μ L RNasin (200U)、Iμ L M-MLV (200 U)，混匀并瞬时离心，42 °C温浴1.5 h，取出后70 °C加热10 min，终止反应。cDNA第一链合成后置于-20 °C保存备用。
[0015]以合成的第一链cDNA为模板，根据三七中与调控三七皂苷生物合成相关的bHLH类转录因子基因cDNA序列设计特异性引物，扩增目的基因PjbHLHl,所用引物序列分别为 5’ -TCTAGAATGGAGGATCCTTATTCCAATATCC-3’ 以及 5’ -CTGCAGTCACATTAACTGTTTGAGAGCTGCG-3’。采用 Advantage? 2 PCR Enzyme (Clontech)扩增出目的基因。PCR 反应条件:94cC 5 min ；94 °C 30 S，54.5 °C 30 S，72 °C I min, 32 cycles ；72 °C 10 min。反应体系(50 yL)为 4 yL 第一链 cDNA、5 μ L 10XBuffer、l μ L 50 X dNTP Mix、0.5 μ L正向引物(10 μΜ)、0.5 yL 反向引物(10 μΜ)、1 μ L Advantage? 2 PCR Enzyme、38 μ LPCR-Grade Water。PCR结束后，取5 μ L用于琼脂糖凝胶电泳，检测扩增产物的特异性以及大小(图2)，其余PCR产物进行胶回收。将目的片段胶回收产物进行TA克隆，反应体系和操作过程为:取3.6 μ L胶回收产物，依次加入0.7 μ L pGEM-T easy vector (50 ng/ μ L)、5 μ L 2 X Rapid Ligat1n Buffer，和 0.7 μ L T4 DNA Ligase 混匀置于 8 °C过夜反应。采用热激转化法将连接产物转入大肠杆菌Transl-Tl中。用含有氨节青霉素(ampicillin，Amp)的LB固体培养基筛选阳性克隆。挑选若干个白色菌落，摇菌后用扩增PjbHLHimf异引物鉴定出多克隆位点插入PjbHLHim克隆，将鉴定的克隆进行测序。
[0016]最终获得的/!7??///cDNA 大小为 966 bp，通过 NCBI ORF finder (http:// www.ncb1.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html)分析发现其正好为开放阅读框(见序列表)。PjbHLHl编码蛋白的分子量约为36.3 KD,等电点为8.36，不稳定系数为39.92，预测尸JMMI编码的蛋白质稳定。生物信息学预测PjbHLHl不包含跨膜区，不含信号肽，具有一个bHLH转录因子特征保守结构域。通过在线工具iPSORT预测PjbHLHl可能定位于细胞核。借助SWISS-MODEL工具，PjbHLHl以Myc原癌基因蛋白为模