一种cd20核酸适配体及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物技术领域，具体地说，本发明涉及⑶20核酸适配体，以及所述适 配体在制备治疗CD20阳性肿瘤药物中的应用及其在制备检测和/或治疗CD20阳性肿瘤细 胞制剂中的应用。
【背景技术】
[0002] 非霍奇金淋巴瘤（NHL)是世界上严重威胁人类健康的肿瘤之一，在过去的50年 中，NHL在世界范围内有着稳定的增长趋势，不容忽视。据统计，它占所有癌症病例数的 5. 1%，在男性常见肿瘤中排名第八位，在女性中是第11位。2008年，共有355900新增NHL 病例，造成了 191400人的死亡。已有研究表明，大多数的NHL来源于B细胞。NHL可在不同 的年龄阶段发生，尤其是在60岁以上的人群身上。
[0003] 临床上治疗NHL的传统方法就是化疗。然而，由于细胞毒药物在杀伤肿瘤细胞的 同时也会对正常组织产生损伤，从而限制了化疗的进度和用药程度，所以化疗很难将患者 体内肿瘤细胞完全去除，导致了肿瘤的复发或者转移。并且，多重化疗药物联合使用会使患 者对药物产生耐药性。所以亟需研发新型的针对NHL的治疗手段。
[0004] 近些年靶向治疗得到了人们的关注。靶向治疗是指将抗肿瘤药物通过靶向分子 特异性地呈递到肿瘤细胞上，使得药物在肿瘤组织上有更高的富集而在正常组织中含量很 少，则药物对肿瘤组织的杀伤增强而对正常组织杀伤较弱，从而有助于清除体内的肿瘤细 胞，并大大降低毒副作用。靶向治疗是有希望改善抗肿瘤化疗疗效的重要方向之一。
[0005] 靶向治疗系统的构建，需要靶向分子和抗肿瘤药物。其中，靶向分子可以与肿瘤细 胞上的肿瘤靶点特异结合。一个理想的肿瘤靶点应在肿瘤细胞膜表面高表达，而在正常组 织或阴性组织中低表达或不表达。⑶20是一个33-37kDa的膜蛋白，它的表达严格遵循B细 胞造血系统。⑶20抗原表达于90%以上的B淋巴瘤细胞，而不表达于造血干细胞、原始B 淋巴细胞、正常血细胞以及其他正常组织。由于80% -85%的NHL来源于B细胞，并且这些 细胞中将近95%的细胞高表达⑶20,所以⑶20是靶向治疗NHL的重要靶点。
[0006] 美罗华是一个CD20的单克隆抗体，它是首个被FDA批准的靶向治疗NHL的药物。 尽管美罗华临床上产生了一定的疗效，但是它仍有一些弊病，比如一些患者对其不敏感，且 一些患者使用一段时间后药物则不再有疗效，并对进一步的治疗产生了抵抗反应。故此，研 发一种新型的靶向CD20阳性NHL的治疗策略是很必要的。
[0007] 近些年，除了单克隆抗体，一些其他类别的靶向分子也得到了人们的关注。核酸适 配体（aptamer)就是其中之一。核酸适配体是一段短链的DNA或RNA，它们可通过碱基之间 的配对以及相互作用产生特有的三维结构，从而与靶标高亲和、高特异地结合。同时，与抗 体相比，核酸适配体还有一些独特的优势，如可大批量合成、成本低、易修饰、易穿透肿瘤组 织、免疫原性低等等。因此，核酸适配体在肿瘤的靶向治疗有重要的应用潜能。然而。到目 前为止，科学文献中还没有报导过针对CD20的核酸适配体。
【发明内容】
[0008] 本发明的目的是提供一种新的⑶20核酸适配体，所述核酸适配体能够与⑶20表 位肽及CD20阳性的肿瘤相结合，所述核酸适配体包括如下核酸序列（SEQIDNO:1) :5'-TG CGTGTGTAGTGTGTCTGTGTGTGTGTAGCGTGTCTGCTCTTAGGGAITTGGGCGG-3 '（下文中，也将该核酸适 配体称为"CZ17"）。
[0009] 进一步地，本发明提供了一种SEQIDNO:1所示核苷酸序列经截断后的 核酸适配体序列，所示经截断后的核酸适配体的核苷酸序列具有与⑶20表位肽及 CD20阳性的肿瘤相结合的能力，优选地，所述经截断后的核酸适配体的核苷酸序列为 5' -TGTAGCGTGTCTGCTCTT-3'。
[0010] 进一步地，本发明所述核酸适配体，在核酸适配体的两端，可以进行基团修饰，所 述修饰的基团可以是选自氨基、羧基、巯基、荧光分子、生物素、胆固醇或聚乙二醇基团修 饰。本发明的一个实施例中，提供了在CZ17的两端分别进行生物素、另一端进行荧光素修 饰后得到的经修饰的核酸适配体分子，经修饰后的核酸适配体分子，具有与CD20表位肽以 及CD20阳性的肿瘤细胞相结合。
[0011] 本发明的再一方面，可以对所述的核酸适配体的碱基进行修饰，如硫代、氨代、氟 代、甲氧基修饰，得到碱基修饰后的核酸适配体分子，优选地，对所述碱基进行硫代修饰，硫 代修饰的方式为将碱基磷酸基团中的氧原子用硫原子替代。本发明的一优选实施例中，将 所述核酸适配体中所有的碱基A进行硫代，得到硫代核酸适配体CZ17,经硫代修饰后，其具 有较未经修饰的核酸适配体更为优异的稳定性，可抗核酸酶。
[0012] 本发明所述核酸适配体，还能够选择性的结合CD20阳性的肿瘤细胞，而与CD20阴 性的细胞结合较弱。
[0013] 更为重要的是，对本发明所述核酸适配体碱基进行修饰后，如对其中的碱基A进 行硫代修饰，相比其它非硫代修饰的单链DNA序列，该硫代修饰的核酸适配体具有了一定 的抵抗核酸酶的能力，在血清中的存在时间显著延长。
[0014] 基于此，该核酸适配体可以直接携带细胞毒性药物（如阿霉素），选择性的杀伤 CD20阳性的肿瘤细胞，因此，本发明的再一方面，提供了本发明所述核酸适配体在制备用于 检测和/或治疗CD阳性的肿瘤（如NHL)制剂中的应用。
[0015] 本发明的有益效果在于：本发明的⑶20核酸适配体具有：（1)能和⑶20表位肽以 较高的亲合力结合，Kd值为100. 7nM; (2)能选择性的结合CD20阳性的肿瘤细胞，而与CD20 阴性的细胞结合较弱；(3)优选地可以直接携带细胞毒性药物阿霉素，选择性的结合并杀 伤CD20阳性的肿瘤细胞。
[0016] 本发明的又一方面，提供了一种组合物，该组合物包括本发明所述的核酸适配体， 以及制药上可接受的载体或赋形剂。
[0017] 本发明中，所述载体如可以是纳米药物载体，将本发明所述核酸适配体偶联到所 述纳米药物载体上（纳米载体如脂质体、胶束、纳米粒等），可以作为CD20靶向分子，用于 CD20阳性肿瘤的靶向治疗，将适配体偶联到纳米载体上的方法，本发明技术人员可以根据 现已有的制剂技术进行。或者本发明所述的载体也可以是造影剂粒子（如纳米铁、包裹了 造影剂的纳米粒等），将所述适配体偶联到造影剂粒子上，作为⑶20靶向分子，用于⑶20阳 性肿瘤的靶向显影，将适配体偶联到造影粒子上的方法，本发明技术人员可以根据现已有 的制剂技术进行。或者，本发明所述的载体还可以是染色分子（如辣根过氧化物酶），作为 ⑶20靶向分子，用于⑶20阳性肿瘤的组化染色。
[0018] 本发明的又一方面，提供了一种药物组合物，所述药物组合物，包括本发明所述的 核算适配体、以及选自至少一种抗肿瘤药物，和制药上可接受的载体或赋形剂。
[0019] 本发明中，所述的核酸适配体和至少一种抗肿瘤药物，所述复合体是所述核酸适 配体与化疗药物形成的复合体，该复合体可用于CD20阳性的肿瘤的治疗。
[0020] 本发明中，抗肿瘤药物，选自抗代谢类抗肿瘤药（如甲氨蝶呤、氟尿嘧啶、氟尿苷、 吉西他滨或雷替曲塞）、抗生素类抗肿瘤药物（如丝裂霉素C、博来霉素、阿霉素、多柔比星、 表柔比星、吡柔比星或米妥蒽醌）、植物碱类抗肿瘤药（如长春碱、紫杉醇或羟基喜树碱）、 激素类抗肿瘤药（如他莫昔芬、来曲唑或强的松）、钼类抗癌药（如顺钼、卡钼、奥沙利钼、奈 达钼或乐钼）或抗肿瘤小分子靶向药物（如吉非替尼、伊马替尼或拉帕替尼）。
[0021] 由于本发明所述核酸适配体能够选择性的结合CD阳性的肿瘤细胞，而与CD20阴 性的细胞结合较弱，因此本发明的又一方面，提供所述适配体作为CD20阳性的肿瘤化疗靶 向药物载体的应用，将化疗药物结合于所述核酸适配体上，进行肿瘤放化疗时，可以选择性 地杀伤CD20阳性的肿瘤细胞，而对正常细胞没有毒性，所述的化疗药物，可以是选自代谢 类药物如甲氨蝶呤、氟尿嘧啶、氟尿苷、吉西他滨、雷替曲塞，抗癌抗生素类药物如丝裂霉 素C、博来霉素、阿霉素、多柔比星、表柔比星、吡柔比星，植物碱类如长春碱、紫杉醇、羟基喜 树碱，抗肿瘤激素类如他莫昔芬、来曲唑、强的松，杂类如顺钼、卡钼、米妥蒽醌，抗肿瘤小分 子靶向药物如吉非替尼、伊马替尼或拉帕替尼，更优选地，所述化疗药物选自氟尿嘧啶、氟 尿苷、甲氨蝶呤、顺钼、吉西他滨、雷替曲塞、丝裂霉素、博莱霉素、长春碱、紫杉醇、羟基喜树 碱、卡钼、他莫昔芬、来曲唑、强的松、吉非替尼、伊马替尼或拉帕替尼。
[0022] 本发明所述核酸适配体还可以偶联到纳米药物载体上，如脂质体、胶束、纳米粒 等，作为CD20靶向分子，用于CD20阳性肿瘤的靶向治疗，基于此，本发明还提供了一种药物 组合物，所述药物包括本发明所述的核酸适配体，至少一种抗肿瘤药物，和药物可接受的载 体，所述核酸适配体与至少一种抗肿瘤药物以复合体形式存在，所述载