，所有试验所用细胞均是处于对数生长期的细 胞；分别收集5XIO5的Raji、Ramos和Jurkat细胞，将其和FITC标记的适配体在200ul结 合缓冲液中于37°C反应30min，PBS洗一遍，用流式细胞仪分析；同等长度随机DNA库作为 随机对照。
[0060] 结果显示，CZ17和Raji，Ramos细胞孵育后的荧光强度明显高于随机对照，见图3A 和图3B所示，而与Jurkat细胞反应后荧光强度与随机对照一致，见图3C所示。上述实验 结果表明CZ17和CD20阳性肿瘤细胞的结合强，和CD20阴性细胞结合弱，CZ17能够识别表 达⑶20蛋白的肿瘤细胞表面的⑶20结构。图中黑色曲线是由随机库单链DNA产生的对照 荧光信号，灰色曲线是CZ17产生的荧光信号。
[0061] 实施4经截断后的CZ17与⑶20表位肽及⑶20阳性肿瘤的结合
[0062] 将截短后的序列5' -TGTAGCGTGTCTGCTCTT-3'经FITC标记后与CD20和BSA包被 的磁珠反应（方法同实施例1)，流式细胞仪检测磁珠表面的荧光强度。结果显示该截短的 序列和CD20仍有较高的结合，而和BSA的结合确很弱（结果见图4)。相同的方法（同实施 例3)检测该序列和⑶20阳性细胞Raji及阴性细胞Jurkat的结合，发现该序列和⑶20阳 性细胞Raji有较高的结合力，而和阴性细胞Jurkat的结合确很弱（结果见图5)。黑色曲 线是由随机库单链DNA产生的对照荧光信号，灰色曲线是CZ17产生的荧光信号。
[0063] 实施例5⑶20核酸适配体携带药物的靶向性
[0064] 荧光光谱分析阿霉素（Dox)嵌入到适配子中：预先在95°C放置5min，立刻冰浴使 其温度迅速降低，取不同量的适配子和3nM阿霉素混匀，适配子和阿霉素的摩尔比例依次 为：0,0. 0001，0. 003,0. 01，0. 1，1和2。在黑色96孔板中37°C静置lh，得到适配体-Dox复 合物，测量适配体-Dox的荧光光谱值。Dox的激发光谱为480nm。发射光谱为520-700nm。 荧光光谱分析表明阿霉素已迁入到适配体中（见图5)游离的阿霉素不可区分肿瘤细胞和 正常细胞，导致细胞中阿霉素的富集程度一样，毒副作用比较大。由于适配体可与肿瘤细胞 上特异表达的⑶20结合，则适配体-阿霉素复合物有可能特异性地被⑶20阳性肿瘤细胞 摄取，而阴性细胞没有这样的亲和作用从而减少了阿霉素的富集。为了验证这个理论，我们 通过共聚焦成像检测了适配体-阿霉素在⑶20-阳性细胞Raji以及阴性细胞Jurkat的摄 入。设立游离Dox组与适配体-dox组，分别与⑶20-阳性细胞Raji以及阴性细胞Jurkat 孵育，共聚焦显微镜观察细胞内dox含量。
[0065] 细胞摄入实验
[0066] 共聚焦显微镜检测：收集Raji和Jurkat细胞，离心去除培养基后用PBS洗一遍， 将I. 5uMdox和适配子-dox(适配子和阿霉素的复合体）分别和这两种细胞于37°C反应 2h，离心后用PBS洗两遍，再用4%多聚甲醛室温固定lOmin，PBS洗2遍后将细胞悬液滴在 载玻片上，封片，荧光共聚焦显微镜检测细胞内dox含量。
[0067] 结果显示，游离Dox组在两种细胞中的含量都很高，说明游离阿霉素对细胞没有 选择性（见图6A和6B)，而适配体-dox组中，Raji细胞中的突光明显高于Jurkat细胞（见 图6C和6D)。从结果中我们可以看出，适配体-Dox在⑶20阳性肿瘤细胞中的摄入明显多 于阴性细胞，适配体-Dox能够被CD20阳性淋巴瘤细胞选择性的摄取。
[0068] 为了进一步验证适配体-Dox能否选择性被⑶20阳性肿瘤细胞摄取，采用游离Dox 和适配子-dox复合体分别和Raji，Jurkat孵育，用流式细胞仪检测其荧光强度的变化。具 体操作步骤为：收集Raji和Jurkat细胞，PBS洗一遍，将3uMdox和适配子-dox分别和两 种细胞于37°C反应4h，PBS洗两遍，流式仪检测。结果表明，对于阳性细胞Raji，游离Dox组 和适配子-dox复合体组的荧光强度没有明显变化（图6E)，而在阴性细胞中，适配子-dox 组的荧光强度明显低于游离Dox(图6F)。图中1代表适配子-dox，2代表游离-dox。
[0069] 实施例6
[0070] 由实施例4的结果可知，适配体-dox被⑶20阴性细胞选择性摄取程度减弱，因此 推测dox对阴性细胞的毒性作用有可能减弱。为了验证这个观点，设立适配体组，游离Dox 组和适配体-dox组，分别与Raji以及Jurkat细胞孵育，MTS方法检测细胞的活力情况。具 体地，采用3uM适配子、游离dox和适配子-dox分别和Raji和Jurkat细胞于37°C孵育4h, PBS洗两遍，加入新鲜培养基孵育48h后MTS法检测细胞的增殖。
[0071] 结果如图6所示，对于⑶20阴性的Jurkat细胞，dox组细胞的存活率为39. 5%， 而适配子-dox组细胞存活率为91. 6%，显示适配子-dox对Jurkat细胞的杀伤显著低于 游离Dox(p< 0. 01)(图6B)。然而，对于⑶20阳性的Raji细胞，Dox组中细胞的存活率为 49. 9%，适配子-dox组中的存活率为43. 1 %，显示适配子-dox对MUCl阳性的A549细胞的 杀伤作用和游离的dox没有显著差别（图7A)。上述实验结果表明适配体-dox能够减弱 Dox对CD20阴性细胞的毒性，而并不影响Dox对CD20阳性细胞的杀伤。需要注意的是，单 纯适配体组中，两种细胞的存活率都接近100 %，表明适配体对这两种细胞并无毒性。
【主权项】
1. 一种核酸适配体，其包含SEQ ID NO :1所示核苷酸序列，或SEQ ID NO :1所示核苷酸 序列经缺失后的序列，所述核酸适配体能够与CD20表位肽相结合。2. 根据权利要求1所述的核酸适配体，其特征在于所述缺失后的核苷酸序列为： 5' -TGTAGCGTGTCTGCTCTT-3'。3. 根据权利要求1所述的核酸适配体，其特征在于所述核酸适配体的两端任选地进行 氨基、羧基、巯基、荧光分子、生物素、胆固醇或聚乙二醇基团修饰。4. 根据权利要求1所述的核酸适配体，其特征在于所述核酸适配体的碱基为经硫代、 氨基、氟基或甲氧基修饰，优选为经硫代修饰，更优选所有碱基A均为硫代修饰。5. 权利要求1-4中任意一权利要求所述核酸适配体在制备用于检测和/或治疗CD20 阳性的肿瘤制剂中的应用。6. -种CD20革巴向分子，所述革巴向分子包括权利要求1-4中任意一权利要求所述的核酸 适配体，以及选自制药上可接受的载体或赋形剂。7. 根据权利要求6所述的靶向分子，其中所述载体选自纳米药物载体（如脂质体、胶束 或纳米粒）、肿瘤显影剂（如铁磁性纳米粒或包裹了显影剂的纳米粒）或染色分子（如辣根 过氧化酶）中的任意一种。8. 权利要求6或7所述靶向分子在CD20阳性肿瘤的靶向治疗药物、CD20阳性肿瘤的 靶向显影或CD20阳性肿瘤的组化染色中的应用。9. 一种药物组合物，所述药物组合物包括权利要求1-4中任意一权利要求所述核酸适 配体，至少一种抗肿瘤药物，以及制药上可接受的载体或赋形剂。10. 根据权利要求9所述药物组合物，其特征在于所述核酸适配体和至少一种抗肿瘤 药物是以复合体形式存在。11. 根据权利要求10所述药物组合物，其中所述抗肿瘤药物选自抗代谢类抗肿瘤药 (如甲氨蝶呤、氟尿嘧啶、氟尿苷、吉西他滨或雷替曲塞）、抗生素类抗肿瘤药物（如丝裂霉 素C、博来霉素、阿霉素、多柔比星、表柔比星、吡柔比星或米妥蒽醌）、植物碱类抗肿瘤药 (如长春碱、紫杉醇或羟基喜树碱）、激素类抗肿瘤药（如他莫昔芬、来曲唑或强的松）、钼类 抗癌药（如顺钼、卡钼、奥沙利钼、奈达钼或乐钼）或抗肿瘤小分子靶向药物（如吉非替尼、 伊马替尼或拉帕替尼）。12. 权利要求11所述药物组合物，包括权利要求1-4中任意一权利要求所述的核酸适 配体，至少一种抗肿瘤药物，和药物可接受的载体或赋形剂，所述核酸适配体与至少一种抗 肿瘤药物以复合体形式存在，所述载体为载药纳米粒。
【专利摘要】一种CD20核酸适配体，其特征在于，该适配体由SEQ？No.1所示的序列组成。在该适配体的两端可进行基团修饰，所述基团为氨基、氨基、羧基、巯基、荧光分子、胆固醇或聚乙二醇的任一种或多种；所述适配体的碱基可做任何修饰，所述修饰为硫代、氨基、氟基、甲氧基或羧基任一种或多种修饰。上述核酸适配体在制备用于检测和/或治疗CD20阳性肿瘤制剂中的应用。制备的治疗CD20阳性肿瘤制剂能选择性的结合CD20阳性的肿瘤细胞，而与CD20阴性的细胞结合较弱。
【IPC分类】A61P35/00, A61K49/00, C12N15/115, A61K47/26
【公开号】CN105087596
【申请号】CN201410221891
【发明人】杨先达, 张李钰
【申请人】中国医学科学院基础医学研究所
【公开日】2015年11月25日
【申请日】2014年5月23日