一种sll0147基因在合成集胞藻类胡萝卜素中的应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种S110147基因在合成集胞藻类胡萝卜素中的应用，特别涉及集胞 藻PCC6803中S110147基因在调控集胞藻PCC6803中玉米黄素生成中的应用，属于基因工 程技术领域。
【背景技术】
[0002] 类胡萝卜素（Carotenoids)是胡萝卜素（Carotenes)和叶黄素（Xanthophylls) 两大类色素的总称，通常是碳氢化合物及其氧化衍生物，由8类异戊二烯单位组成，是 一类重要的天然色素，目前已发现的类胡萝卜素有700多种，常见的有a-胡萝卜素 (a-Carotene)、0 -胡萝卜素（0 -Carotene)、玉米黄素（Zeaxanthin)、叶黄素（Lutein)和 4下青素（Astaxanthin)等。
[0003] 类胡萝卜素在自然界中分布广泛，主要由植物、藻类、蓝藻以及一些细菌、真菌等 微生物合成，动物自身不能合成类胡萝卜素，只能通过食物链获取。在光合生物中，类胡萝 卜素作为捕光色素成分参与光合作用和通过清除自由基的参与抗光氧化的保护作用，同时 在动物和人类体内也发挥着重要作用。例如类胡萝卜素（尤其是(6-胡萝卜素）是作为人 体内维生素A的重要来源，类胡萝卜素如番茄红素、(6-胡萝卜素、虾青素及叶黄素等具有 很强的抗氧化活性，可以有效地抑制自由基的产生，阻断体内的链式自由基反应，阻止脂质 过氧化，延缓衰老和老年动脉粥样硬化的形成。它同样可以治疗疾病并提高机体免疫力。同 时，类胡萝卜素也具有较大的医用价值，人类摄食类胡萝卜素不仅可以预防眼病、心血管病 的发生，还可以增强生物机体的特异性及非特异性免疫功能，增强肿瘤免疫。
[0004] 目前，在国内外市场上，类胡萝卜素主要作为医药原料、功能食品、膳食补充剂和 饲料色素，价格昂贵，市场需求量极大。功能性天然色素的类胡萝卜红素在医药、食品、化妆 品等方面都有着良好的应用前景，它的开发应用将给农业、食品加工业、医药行业等相关的 行业带来可观的经济效益，具有广阔的市场前景。类胡萝卜素的生产方法包括化学合成法、 微生物发酵法和天然植物提取法三种。其中天然提取法正逐步成为类胡萝卜素生产的主要 方法。从植物资源中提取主要是以果蔬为原料，存在成本高、生产工艺复杂、产品得率偏低 等问题，目前此方法已不占主导地位。与植物相比，大多数的藻类能够合成类胡萝卜素，如 蓝藻中的北冰洋聚球藻能合成玉米黄素、(6-胡萝卜素、隐黄质等，红球藻（Haematococcus pluvialis)在氮磷饥饿条件下，细胞中的虾青素积累增大，绿藻中的杜氏藻（Dunaliella) 能大量积累(6-胡萝卜素。同时由于微藻不与农作物争地、争水；在环境胁迫如缺氮等条件 下，有些单细胞微藻可大量积累类胡萝卜素，所以有很多利用微藻生产高附加值物质的研 究。而随着代谢工程技术的发展及日趋成熟，通过改造、阻断及引入新的代谢途径来提高细 胞内类胡萝卜素的含量，可以在提高目标产物的得率同时减少副产物的生成。
[0005] 近年来，应用类胡萝卜素合成相关基因的转基因植物研究取得了较大进展。类 胡萝卜素生物合成的第一步是由八氢番茄红素合酶（PSY)催化两个栊牛基栊牛基焦磷酸 (GGPP)分子合成八氢番茄红素（phytoene)。PSY是类胡萝卜素生物合成途径中的一个关键 调节酶，其编码基因成为植物类胡萝卜素遗传工程中的首选目的基因。GGPP是许多途径的 反应前体，在番茄中过量表达PSYl基因时，GGPP大量转向合成类胡萝卜素，而赤霉素的合 成水平下降。在油菜种子中过量表达细菌的PSY基因发现成熟的种子中类胡萝卜素含量增 加了 50倍。在水稻胚乳中共表达水仙的PSY基因、LCY基因和细菌的CRTI基因，结果转基 因水稻种子胚乳中积累了大量P_胡萝卜素及其氧化产物叶黄体素、玉米黄质等，这种水 稻米粒金黄，被誉为"金色水稻"。利用果实特异性启动子在番茄中过量或反义表达Lcy-b 基因，结果发现过量表达的转基因植株果实中的(6-胡萝卜素含量大量增加。过量表达番 茄红素(6-环化酶基因的转基因番茄，发现番茄红素向(6-胡萝卜素的转化加强，而且总类 胡萝卜素的含量也增加了 50%以上。在拟南芥中过量表达胡萝卜素羟化酶（BCH)使叶黄素 的含量增加，其他类胡萝卜素的含量并没有明显的降低。不过，通过基因工程技术提高植物 的类胡萝卜素含量和种类，还面临着许多问题，如前体GGPP的供应与几种物质代谢调控的 平衡等。
[0006] 蓝藻（cyanobacteria)又称蓝细菌，是一类能进行光合作用的原核生物。蓝藻细 胞可以利用简单的无机物合成有机物，所表达的外源基因产物不形成包含体，并且多数蓝 藻及其提取物对人畜无毒，是转基因研究的良好受体。集胞藻PCC6803(Synechocystissp. spPCC6803)做为一种单细胞蓝藻，具有生长速度快、培养条件简单、不产生毒素、细胞结构 简单、遗传背景清楚、方便分子操作等特点，适合于利用广核生物反应器大规模生产，是很 好的蓝藻基因工程受体。鉴于蓝藻表达的外源基因产物易纯化、不含毒素、藻细胞培养成本 低且不容易污染等的优点，随着藻类基因工程的发展，使利用蓝藻作为外源基因表达载体 以生产药物等高附加值产品成为可能。
[0007] 集胞藻PCC6803中显著积累四种类胡萝卜素，S卩(6-胡萝卜素（p-carotene)、玉 米黄素（zeaxanthin)、海胆酮（Echinenone)和蓝藻叶黄素（Myxoxanthophyll)。目前，已 经从集胞藻PCC6803中克隆到6个与类胡萝卜素合成有关的基因，它们参与了从栊牛基栊 牛基焦磷酸（GGPP)的合成到(6-胡萝卜素的羟基化与酮基化反应。分别为编码八氢番茄 红素合成酶的crtB，编码八氢番茄红素脱氢酶的crtP，编码胡萝卜素脱氢酶的crtQ，编 码P-胡萝卜素酮醇酶的crt0,编码P-胡萝卜素羟化酶的crtR，和编码胡萝卜素异构酶 的crtH。
[0008] 番茄红素是类胡萝卜素合成途径中的重要分支点，在不同环化酶的作用下形成一 系列的胡萝卜素。已从聚球藻7942中克隆了编码番茄红素环化酶的CrtL。近年来，在绿 硫细菌中发现了一类新的双功能番茄红素环化酶基因CruA，在大肠杆菌中可以将番茄红素 转化为y_胡萝卜素。而在聚球藻7002(Synechococcussp.PCC7002)中也发现了同源基 因CruA和CruP。集胞藻PCC6803中不含crtL-e，而尚未见有关crtL-b的报道。集胞藻 PCC6803中S110147基因与聚球藻CruA氨基酸相似性为63. 32%，已有研究表明，S110147 的突变对番茄红素环化过程影响不明显，但尚没有对集胞藻PCC6803中S110147基因在提 高集胞藻PCC6803P-胡萝卜素合成方面应用的报道。
【发明内容】
[0009] 本发明针对现有技术的不足，提供一种S110147基因在合成集胞藻类胡萝卜素中 的应用。利用过表达方法增加S110147基因的表达后，发现转基因藻类胡萝卜素组分百分 含量有明显变化，其中蓝藻叶黄素含量增加了 47. 4 %，玉米黄素含量增加了 93. 8 %，而海 胆酮含量和0 _胡萝卜素百分含量则明显降低，分别降低了 60. 9%和15. 9%。
[0010] 本发明技术方案如下：
[0011] -种S110147基因在合成集胞藻类胡萝卜素中的应用，所述的S110147基因核苷 酸序列如SEQIDNO. 1所示。
[0012] 上述应用，步骤如下：
[0013] (1)以psbA20RF前500bp片段为启动子片段，与S110147基因进行基因融合，制得 融合片段Promotor+sll0147 ;
[0014] 所述psbA20RF的核苷酸序列如SEQIDNO. 3所示；
[0015] (2)制备同源重组上游臂slrl285U基因片段，核苷酸序列如SEQIDNO. 4所示；
[0016] (3)制备同源重组下游臂slrl28ro基因片段，核苷酸序列如SEQ ID NO. 5所示；
[0017] (4)通过对质粒pKK233-2进行扩增，向大肠杆菌T1T2终止子中引入PstI、 BamHI酶切位点，经PstI、BamHI内切酶酶切后，与同样经PstI、BamHI内切酶酶切的质粒 pBluescriptSK连接，制得质粒pBluescriptSKT1T2;
[0018] (5)用KpnI内切酶酶切步骤⑵制得的同源重组上游臂slrl285U基因片段， 与同样经KpnI内切酶酶切的步骤（4)制得的质粒pBluescriptS