加入至Col2-ll。然后，将IOOyL从Coll转移至Col2,小心地慢慢混合（不起气 泡）8-10次，然后继续将100 1^从(：〇12转移至(：〇13，并重复直至到达(：〇111。留下(：〇112 为未刺激的对照孔。然后，用连续稀释的野生型（WT)犬瘦素和实施例1的PEG化多肽刺激 细胞。将细胞从培养箱取出，并且小心地从各个孔吸出培养基。然后，将l〇〇yL/孔的连续 稀释的WT和PEG化多肽从深孔稀释块转移至96孔测定板中的细胞。然后，水平越过下一 可用行建立所测试的WT和PEG化多肽的一式两份样品。将板在37°C、5%CO2培养箱中孵 育16-18小时。以下显示了具有以ng/mL计的最终浓度的板格式。
[0035]
[0036] 第三天
[0037] 在第三天，准备底物，并添加至细胞，然后由光度计测量它们。在读取板之前大 约1-2小时，在室温下解冻一组Steady-Glo(Promega)试剂，其包括：每测定板一小瓶 的Steady-Glo冻干的萤光素酶测定底物和一小瓶的Steady-Glo萤光素酶测定缓冲液。 将萤光素酶测定缓冲液（~10. 5mL)的全部内容物移液到冻干的萤光素酶底物中。将 100yL/孔的重构的萤光素酶底物添加至测定板的每个孔，并且用铝箱覆盖测定板，并在室 温下在设置为450至600rpm的板摇动器上孵育45-60分钟。然后，在TecanGENiosPRO 板读取器上用设置为250毫秒的积分时间来读取板。然后，将数据输入到Excel中，在 SigmaPlotApplication上进行EC50测定，并且也进行了相对于WT瘦素的倍数损失活性 (foldlossactivity)和百分比相对效力测定。将相对于野生型犬瘦素的倍数损失活性测 定为[样品的EC50]除以[野生型瘦素的EC50];瘦素蛋白与参考标准品的％相对效力通过 用参考标准品的EC50除以瘦素蛋白的EC50值并乘以100来计算。例如，％相对效力计算 为[参考标准品的EC50]除以[样品的EC50]X100。下表显示了使用这些方法分析的WT 和实施例1的PEG化多肽。
[0038] 表 1
[0039]
[0040] 结果表明实施例1的PEG化多肽在体外是有活性的。
[0041 ] 体内牛物数据
[0042] 这个研究的目的是评价实施例1的PEG化多肽对肥胖的雄性和雌性犬中体重、身 体组成和喂养行为的影响。将实施例1的PEG化多肽在有7. 4的pH和4% (w/v)海藻糖的 磷酸盐缓冲盐水中配制成5.lmg/ml。
[0043] 使用十八（18)只全部超过一（1)岁龄的犬：九（9)只未阉割的雄性和九（9)只未 阉割的雌性小猎犬。犬是肥胖的，重约12至18kg(26. 4至39. 61bs)。在第一个四周的适应 期期间，（或者直至达到所需的起始重量），犬饲喂实验室高脂肪（约45%)的干燥食物， 其满足或超过维持和健康的营养需求。在适应期的这个部分所有的犬都自由饲喂以促进重 量增加。在适应期的最后两周期间和该研究的剩余时间，所有的犬均饲喂商品化的正常脂 肪（大约12% )的干燥犬粮，以便减少内源性瘦素水平，并恢复瘦素敏感性。治疗组1和2 中的犬在该研究的整个剩余时间期间继续自由地提供食物。治疗组3中的动物按照饮食的 标签说明每天饲喂两次。通过碗或在各个笼中含有的自动给水系统，允许动物自由地获取 水。在研究过程期间，不施用任何其它伴随药物。
[0044] 这个研究是在每一性别中作为随机区组设计来实施的。犬被随机分配到圈。通过 在每一性别中基线（第-14天（Day-14))体重将动物划分区组（blocked)。存在有三只雄 性的三个区组和有三只雌性的三个区组。雄性区组一由三只具有最低体重的雄性组成，且 雌性区组一将由三只具有最低体重的雌性组成。在每一性别中的第二区组由具有其次最低 体重的三只雄性和三只雌性组成。在每一性别中最后一个的区组包含具有最高体重的三只 雄性和三只雌性。
[0045] 下表显示了使用的治疗、剂量方案和动物数量。
[0046]表2
[0047]
[0048] 将动物分入九只动物的两个性别组中。在每一性别组内，基于第-14天的体重，将 动物从最低到最高排名。基于渐增的基线体重，将每一性别组中的动物分入三只动物的区 组中。使用由赞助商提供的随机化表格，将动物随机分配至圈位置。
[0049] 通过皮下注射在第0、7、14、21、28天向对照和治疗组施用。在将动物转换至低脂 肪配给之前，在第-14天研究中登记之前，获得血清样品（大约2_3ml)，以便使犬适应放血 操作，并建立基线内源性瘦素水平。下表提供了在第-14天和第-1天的循环瘦素水平。
[0050]表 3
[0051]
[0052] 在第-1天、第21天和第42天（研究的最后一天），将所有三个治疗组中的动物都 进行DEXA(双能X射线吸收法）扫描，以确定瘦肉相比于脂肪组织的百分比。
[0053] 对于登记在治疗组1和2中的动物，在第-7天至第42天在大约各自相同的时间， 记录每天的饲料消耗。
[0054] 在所有治疗组中的动物在第-7天开始每天24小时录像记录，并持续至研究结束， 来观察包括每天进餐次数和每餐饲喂的平均持续时间在内的饲喂行为。
[0055] 在研究过程中每周各个动物体重中的初级终点（primaryendpoint)将改变，并且 这些将被概述并与治疗组比较。次级终点将是：
[0056] 1)身体组成：在研究过程中将概述各个动物的DEXA扫描结果（包括瘦肉和脂肪 组织的百分比）；和
[0057] 2)饲料消耗/饲喂行为：对于每一动物，将概述在治疗1和2中各个动物的平均 每天饲料消耗。
[0058] 将观察记录各个动物饲喂行为的录像来确定在开始治疗之前和在开始治疗之后 每一动物消耗的进餐次数和进餐持续时间。
[0059] 对体重影响的结果提供在下表中。
[0060] 表 4
[0061]
[0062] Ap= 0. 001；Bp= 0. 002〇
[0063] 这些结果表明：与对照组相比，用实施例1的化合物治疗的组减轻了更多的重量。
[0064] 对身体组成的影响提供在下表中。
[0065]表 5
[0066]
[0067] Ap= 0. 006；Bp= 0. 049；cp= 0. 022；Dp= 0. 038〇
[0068] 这些结果表明：与对照组相比，用实施例1的化合物治疗的组具有与脂肪组织百 分比优先降低相关的身体状况评分（bodyconditionscores)中的减少并且对组织的百分 比没有显著影响。
[0069] 对饲料消耗和行为的影响提供在下表中。
[0070] 表 6
[0071]
[0072] 这些结果表明：与对照组相比，用实施例的化合物治疗的组消耗更少的食物，并且 与每天消耗的进餐次数相反，食物摄入的减少与进食花费的时间减少相关。
【主权项】
1. 一种包含SEQ ID NO :1的多肽和聚乙二醇（PEG)部分的化合物，其中所述PEG部分 共价连接至所述SEQ ID NO :1的多肽的对-乙酰-苯丙氨酸（pAF)残基。2. 权利要求1所述的化合物，其中所述PEG部分具有约30k Da的分子量。3. 权利要求2所述的化合物，其中所述PEG部分是a -甲基-co -氨基乙氧基氨基甲酰 基、或聚氧乙烯。4. 一种治疗陪伴动物中肥胖的方法，其包括将有效量的权利要求1-3任一项所述的化 合物施用至有需要的动物。5. -种预防陪伴动物中肥胖的方法，其包括将有效量的权利要求1-3任一项所述的化 合物施用至有需要的动物。6. 权利要求1-3任一项所述的化合物，其用于治疗。7. 权利要求1-3任一项所述的化合物，其用于治疗动物中的肥胖。8. 权利要求1-3任一项所述的化合物，其用于预防动物中的肥胖。9. 一种组合物，其包含权利要求1-3任一项所述的化合物和一种或多种载体、稀释剂 或赋形剂。
【专利摘要】提供修饰的犬瘦素多肽及其制剂和用途，包括聚乙二醇(PEG)修饰的犬瘦素多肽，其中所述PEG部分共价连接至所述多肽的对-乙酰-苯丙氨酸(pAF)残基，以及可用于治疗陪伴动物肥胖和其它瘦素相关病症的相关组合物和方法。
【IPC分类】C07K14/575
【公开号】CN105121461
【申请号】CN201480014677
【发明人】M·布勒瑟, P·C·肯宁, M·德古斯曼, N·克努森, I·瓦伦塔
【申请人】伊莱利利公司, Ambrx公司
【公开日】2015年12月2日
【申请日】2014年3月12日
【公告号】CA2901928A1, WO2014165189A2, WO2014165189A3