一种肠球菌y12及其用图
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种菌株，特别是，一种肠球菌5A )Y12,本发明还公 开了该菌株的用途。
【背景技术】
[0002] 水体富营养化是指在人类活动的影响下，大量氮、磷等富营养物质进入养殖池、湖 泊、浅海等缓流水体，使得藻类等浮游生物爆发性繁殖，迅速消耗水体溶解氧，引起水质恶 化，导致鱼类、虾蟹等水生生物大量死亡的现象。同时，由于水体的富营养化，水底堆积的有 机物质被厌氧微生物分解产生有害气体以及一些浮游生物产生生物毒素，都对水产养殖动 物产生重大威胁。因此，对于水产养殖业来说，水体富营养化是制约其发展的关键性问题。 而水产养殖业由于工厂集约化养殖的快速发展，为追求经济效益，各养殖场常滥施药物以 及大量使用人工饲料，导致养殖水体中经常出现氨氮污染现象，而氨氮污染是水体富营养 化的主要原因之一。
[0003] 近几年频繁发生的养殖水体氨氮污染事件，给水产养殖业，特别是海水养殖业带 来了严重的经济损失。因此对养殖水体中氨氮浓度的控制以及如何高效地解决养殖水体中 氨氮污染的问题，对水产养殖的发展有重要意义。
【发明内容】
[0004] 本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提供一种新的肠球菌 (i^terococci/6 1 5A )Y12,该菌株为一种高效降氮的氨氧化细菌，可以用于海水养殖池废 水处理，优化海水养殖环境。
[0005] 本发明所要解决的另一个技术问题是提供了肠球菌（办5A )Y12的 用途。
[0006] 本发明所要解决的技术问题是通过以下的技术方案来实现的。本发明是一种肠球 菌（汾耶.）Y12,其特点是，其保藏号为CCTCCNo:M2015474。 本发明菌株肠球菌（汾) Y12 (以下简称肠球菌Y12或者Y12)为从海 水养殖池底泥样品中通过富集、分离出氨氧化细菌，模拟海水养殖废水筛选，获得高效降氮 的氨氧化细菌。该菌株已于2015年7月23日保藏在中国典型培养物保藏中心CCTCC，保藏 编号为CCTCC No :M2015474 ;保藏单位地址：武汉市武汉大学，电话：027-68754052,邮编： 430072。
[0007] 本发明所述的肠球菌Y12,其优选的保藏方法为：将菌株接入含3% NaCl的LB培 养基，在28°C，180 rpm下培养24 h，得发酵液；取1. 5 mL离心管，按1:1的比例将发酵液 与灭过菌的30 %甘油混合装入其中，颠倒数次混匀后放入-40 °C冰箱保存。
[0008] 本发明所述的肠球菌Y12,其分离筛选方法如下： (1)富集：采集虾蟹贝混养池底泥5 g，转入装有100 mL已灭菌的氨氧化细菌富集培养 基500 mL三角瓶，再加入十多粒玻璃珠，在28°C，180 rpm培养3 d后，用移液器吸取5 mL移 入含有100 mL新鲜富集培养基的500 mL三角瓶中，再富集3 d;依次类推，共富集三次；得 富集液；氨氧化细菌富集培养基的配方是：胰蛋白胨5.0 g，MgS04*7H20 0. 5 g，FeS04*7H20 0? 1 g，KC1 0? 3 g，陈海水 1000 mL，pH 7. 2 ; (2) 分离纯化：取1 mL上述富集液转入装有9 mL无菌水的试管中，混匀，按10 \ 10 2、 10 3、10 4、10 5、10 6 6个梯度稀释；分别吸取0.1 mL涂布于氨氧化细菌分离培养基上并标 记；分离培养基是在富集培养基基础上多加其质量的2%的琼脂；将已涂布的平板于28°C下 培养48 h ;待菌落可用肉眼明显辨别时，借助放大镜仔细挑选出颜色、形态等特征有差异的 单菌落，然后进行三区划线，于28°C下培养48 h ;重复三区划线分离单菌落直至得到纯培 养物 13 个菌株，分别编号为 Yl，Y2, Y3, Y4, Y5, Y6, Y7, Y8, Y9, Y10, Yll，Y12, Y13; (3) 筛选： 氨氧化细菌筛选培养基：葡萄糖 5. 0 g，（NH4)2S04 0? 25 g，K2HP04 0? 5 g，MgS04 ? 7H20 0? 25 g，陈海水 1000 mL，pH 7. 2; 参照GB17378. 4-2007次溴酸盐氧化法测定氨氮含量；制备100 mg/L (NH4)2S04标准贮 备溶液，稀释测定各标准（册14)2304浓度下的A 543，以（NH4)2S(V^度为横坐标，A 543为纵坐标 制作标准曲线； 在含50 mL氨氧化细菌筛选培养基的250 mL三角瓶中，分别接入所述的13个菌株，每 种菌株接种3瓶，28°C，180 rpm培养36 h;分别取样10 mL，在8000 rpm离心3 min，测定 上清液A543，并根据标准曲线计算氨氮含量，按下列公式计算氨氮降解率： 氨氮降解率(％)=(起始氨氮含量-降解后氨氮含量）/起始氨氮含量X 100 筛选得到对氨氮的降解能力最强的菌株Y12。
[0009] 本发明所述的肠球菌（iiterococciAs 5/7. )Y12可以用于海水养殖池废水氨氮降解 处理。该菌株为一种高效降氮的氨氧化细菌，可以用于海水养殖池废水处理，优化海水养殖 环境。
【附图说明】
[0010] 图1为氨氮测定的标准曲线图； 图2为不同菌株对培养基中氨氮的降解率柱形图； 图3 - 4为菌株Y12的形态特征图； 图5为菌株Y12 16S rDNA扩增图； 图6为菌株Y12系统发育树； 图7为菌株Y12的生长曲线及各生长时期的氨氮含量曲线图。
【具体实施方式】
[0011] 以下参照附图，进一步描述本发明的具体技术方案，以便于本领域的技术人员进 一步地理解本发明，而不构成对其权利的限制。
[0012] 实施例 1，一种肠球菌（及耶.）Y12 :其保藏号为 CCTCC No :M2015474。
[0013] 实施例2,实施例1所述的肠球菌Y12的分离筛选、保存与用途实验： 1. Y12菌株的分离筛选及保存 1. 1氨氧化细菌的富集 在连云港市赣榆县某虾蟹贝混养池采集底泥5 g，转入装有100 mL已灭菌的氨氧化细 菌富集培养基500 mL三角瓶，再加入十几粒玻璃珠，在28°C，180 rpm培养3 d后，用移液器 吸取5 mL移入含有100 mL新鲜富集培养基的500 mL三角瓶中，再富集3 d。依次类推，共 富集三次。氨氧化细菌富集培养基的配方是胰蛋白胨5.0 g，MgS04*7H20 0. 5 g，FeS04*7H20 0? 1 g，KC1 0? 3 g，陈海水 1000 mL，pH 7. 2。
[0014] 1. 2氨氧化细菌的分离纯化 取1 mL上述富集液转入装有9 mL无菌水的试管中，混勾，按10 \ 10 2、10 3、10 4、10 5、 10 6 6个梯度稀释。分别吸取0. 1 mL涂布于氨氧化细菌分离培养基上并标记。分离培养基 是在富集培养基基础上多加2%的琼脂。将已涂布的平板于28°C下培养48 h。待菌落可用 肉眼明显辨别时，借助放大镜仔细挑选出颜色、形态等特征有差异的单菌落，然后进行三区 划线，于28°C下培养48 h。重复三区划线分离单菌落直至得到纯培养物。本次得到13个 菌株，分别编号为Y1，Y2, Y3，……Y13。
[0015] 1.3菌种保藏 将纯化的单菌落接入含3% NaCl的LB培养基，在28°C，180 rpm下培养24 h。取1. 5 mL离心管3-5支，按1:1的比例将发酵液与灭过菌的30 %甘油混合装入其中，颠倒数次混 匀后放入-40 °C冰箱保存。
[0016] 氨氧化细菌的筛选 氨氧化细菌筛选培养基：葡萄糖 5. 0 g，（NH4)2S04 0? 25 g，K2HP04 0? 5 g，MgS04 ? 7H20 0? 25 g，陈海水 1000 mL，pH 7. 2。
[0017] 2. 1氨态氮测定标准曲线的制作 参照GB17378.4-2007次溴酸盐氧化法测定氨