028] 1. 3抗菌肽的纯化及鉴定
[0029] 用反向高效液相色谱法对抗菌肽进行纯化鉴定。采用C18半制备柱，流动相：
[0030] A 相（水相）：去离子水（含 0? 1 % TFA (m/v));
[0031 ] B相（有机相）：80 %乙腈水溶液（含0? 1 % TFA (m/v));
[0032] 流速：6ml/min ;洗脱梯度：A相以每分钟1 %的变化从55%降到10%，B相以每分 钟1 %的变化从45 %升到90 %。
[0033] 根据高效液相色谱图（见图1)采集24-26min的洗脱液，采用旋转蒸发仪除去洗 脱液中的有机相乙腈，之后将剩余的抗菌肽水溶液放入冰箱冷冻成冰块，最后用冷冻干燥 机除去水分，得到蓬松固体粉末，为抗菌肽纯品。图2为其质谱图。
[0034] 按照上述相同的方法合成了序列分别为Phe-Lys-Val-Gly-Gly-Phe-Ile-Lys-Lys -Val-Trp-Arg-Ser-Ile-Val-Ala(多肽2)、Phe-Lys-Ile-Gly-Gly-Phe-Val-Lys-Lys-Leu_T rp-Arg-Ser-Val-Leu-Ala (多肽 3)和 Phe-Lys-Leu-Gly-Gly-Phe-Leu-Lys-Lys-Ile-Trp-A rg-Ser-Leu-Ile-Ala(多肽 4)的多肽。
[0035] 实施例2 :抗菌肽的抗菌活性测定
[0036] 1)取不同菌种隔夜培养的细菌菌液100 y 1，于10ml新鲜培养基中稀释，培养至对 数生长期（〇D57。为0. 6-0. 8)，然后稀释至0D值为0. 3备用。
[0037] 2)将配好的BSA溶液用0? 2 y m膜过滤，BSA溶液组成为20mg牛血清蛋白，10ml 水，1 u L乙酸。
[0038] 3)用过滤好的BSA溶液以倍比稀释法分别稀释多肽Phe-Lys-Ile-Gly-Gly-Phe-I le-Lys-Lys-Leu-Trp-Arg-Ser-Leu-Leu-Ala (多肽 1)和 Phe-Lys-Ile-Gly-Gly-Phe-Ile-L ys-Lys-Leu-Trp-Arg-Ser-Lys-Leu-Ala (多肽 C)。终浓度为 10-320 uM〇
[0039] 4)将0D值0. 3的菌液稀释100倍备用。取96孔板，于空白对照组中加入180 y 1 新鲜培养基和20 y 1 BSA溶液；于阴性对照组中加入180 y 1菌液和20 y 1 BSA溶液；于测 试组中分别加入180 y 1菌液和20 y 1不同浓度的多肽溶液，多肽终浓度为分别为1、2、4、8、 16、32 yM。一个96孔板中所加多肽为本发明的抗菌肽Phe-Lys-Ile-Gly-Gly-Phe-Ile-Ly s-Lys-Leu-Trp-Arg-Ser-Leu-Leu-Ala (多肽 1)，另一个 96 孔板中所加多肽为 Phe-Lys-Ile -Gly-Gly-Phe-Ile-Lys-Lys-Leu-Trp-Arg-Ser-Lys-Leu-Ala (来自于毒性蛋白 Mauriporin 的多肽C)。
[0040] 5)将加好的板标注好时间、日期、菌种等，放培养箱，37°C培养16_24h。
[0041] 6)采用酶标仪测定每个孔的0D值，并计算抑菌率：
[0042] 抑囷率=(1-0D测试组/ODp月性对照组）*100%
[0043] 多肽的最低抑菌浓度（Minimal inhibitory concentrations，MIC)为杀死 90% 细菌的多肽的最低浓度。本发明的抗菌肽Phe-Lys-ne-Gly-Gly-Phe-Ile-Lys-Lys-Leu-T rp-Arg-Ser-Leu-Leu-Ala (多肽 1)和多肽 Phe-Lys-Ile-Gly-Gly-Phe-Ile-Lys-Lys-Leu-T rp-Arg-Ser-Lys-Leu-Ala (多肽C)的最低抑菌浓度见下表1 :
[0044] 表1最低抑菌浓度
[0045]
[0046]
[0047] 注：N表示未做，表示对无抗菌作用
[0048] 上述实验结果表明，本发明的抗菌肽（多肽1)抗菌活性明显高于多肽C，且具有广 谱的抗菌效果。按照上述相同的方法测试了多肽2、3和4的抗菌活性，结果表明这些多肽 均具有优异的抗菌活性，均明显高于多肽C。
[0049] 实施例3洗手液
[0050] 制备具有如下组成的含有本发明的抗菌肽多肽1的洗手液：
[0051]
[0052] 。
[0053] 实施例4漱口水
[0054] 制备具有如下组成的含有本发明的抗菌肽多肽2的漱口水：
[0055]
[0056] 。
[0057]
【主权项】
1. 一种抗菌肽，其特征在于，所述抗菌肽的序列为： Phe-Lys-X1-Gly-Gly-Phe-X2-Lys-Lys-X3-Trp-Arg-Ser-X4-X5-Ala? 其中，\444和乂5各自独立地为1^11、116或￥&1;优选4 1和乂2各自独立地为116， X3、XdPX5各自独立地为Leu ;更优选所述抗菌肽的序列为： Phe-Lys-Ile-Gly-Gly-Phe-Ile-Lys-Lys-Leu-Trp-Arg-Ser-Leu-Leu-Ala； Phe-Lys-Val-Gly-Gly-Phe-Ile-Lys-Lys-Val-Trp-Arg-Ser-Ile-Val-Ala； Phe-Lys-Ile-Gly-Gly-Phe-Val-Lys-Lys-Leu-Trp-Arg-Ser-Val-Leu-Ala ;或 Phe-Lys-Leu-Gly-Gly-Phe-Leu-Lys_Lys_IIe-Trp-Arg-Ser-Leu-Ile-Ala〇2. -种组合物，其特征在于，含有如权利要求1所述的抗菌肽或其任意混合物。3. 如权利要求2所述的组合物，其特征在于，所述组合物为洗手液、洗面奶、洗发香波、 沐浴液、女性护理洗液、漱口水、牙膏、香皂、化妆品、洗衣皂、洗衣液、洗涤灵、消毒液或洁厕 液等。4. 一种织物，其特征在于，含有如权利要求1所述的抗菌肽或其任意混合物。5. 如权利要求4所述的织物，其特征在于，所述织物为衣物、床上用品、消毒纸巾、敷料 或绷带等。6. -种卫生巾、卫生护垫、尿不湿或成人用尿垫，其特征在于，含有如权利要求1所述 的抗菌肽或其任意混合物。7. -种饲料，其特征在于，含有如权利要求1所述的抗菌肽或其任意混合物。8. -种药物组合物，其特征在于，含有如权利要求1所述的抗菌肽或其任意混合物。9. 如权利要求1所述的抗菌肽或其任意混合物在制备用于预防和/或治疗细菌感染的 药物中的应用。10. 如权利要求1所述的抗菌肽或其任意混合物在制备具有抑菌和/或杀菌性能的产 品中的应用。
【专利摘要】本发明涉及一种抗菌肽，该抗菌肽的序列为Phe-Lys-X1-Gly-Gly-Phe-X2-Lys-Lys-X3-Trp-Arg-Ser-X4-X5-Ala，其中，X1、X2、X3、X4和X5各自独立地为Leu、Ile或Val，该抗菌肽具有广谱的抗菌特性，不仅活性更高，而且稳定不易失活。
【IPC分类】A61F13/496, A61F13/472, C07K7/08, A61F13/02, A61K38/10, A61P31/04, A61F13/15, A23K1/16, A61M35/00
【公开号】CN105153285
【申请号】CN201510594440
【发明人】罗施中, 贾丽丽, 周希蕊, 田希博, 刘竹青
【申请人】北京化工大学
【公开日】2015年12月16日
【申请日】2015年9月17日