抗菌肽hp10及其制备方法和应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于含5-20个氨基酸的肽合成技术领域以及化合物和药物制剂的特定治 疗活性技术领域，具体涉及抗菌肽HP10及其制备方法和应用。
【背景技术】
[0002] 饲用抗生素在全球畜牧业的发展过程中发挥了至关重要的作用。近年来，为了追 求更大的经济效益，动物生产中抗生素的滥用现象日趋严重，这不仅造成了动物性食品中 的兽药残留问题，还导致了耐药菌株的产生，给畜牧业的可持续发展带来了严重的困扰。因 此，欧盟和韩国等发达国家已经全面禁止畜禽饲料中使用抗生素，寻找抗生素替代品便成 为动物营养研究中的一大热点，特别是仔猪营养，因为仔猪免疫系统发育并不完善，很容易 感染有害细菌而影响其生产性能，严重者甚至死亡。
[0003] 抗菌肽是由生物体基因编码且在核糖体内合成的小肽类物质，是动物非特异性免 疫的一个重要组成部分，其具有抗细菌、抗病毒、抗真菌以及杀灭寄生虫等多种生物学功 能，特别是对多重耐药菌具有强大的杀伤作用。抗菌肽对机体无毒副作用、无残留且不易产 生耐药性，因此，开发抗菌肽制剂替代饲用抗生素已经成为国内外动物生产领域的研究热 点。然而，天然来源的抗菌肽大多存在分子量大而具有免疫原性、抗菌活性不高、对动物细 胞具有毒副作用或会导致溶血等缺陷，在一定程度上限制了抗菌肽在生猪养殖中的推广应 用。通过分子设计和改造获得分子量小、抗菌活性高和对动物细胞无毒副作用的抗菌肽是 促进抗菌肽在生猪养殖中应用的有效手段。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的在于公开了一种抗菌肽HP10。
[0005] 本发明的第二个目的在于公开了抗菌肽HP10的制备方法。
[0006] 本发明的第三个目的在于公开了抗菌肽HP10的应用。
[0007] 本发明的目的是通过以下技术方案实现的：
[0008] 抗菌肽HP10,其中，所述抗菌肽HP10的氨基酸序列为HHHLHHIHKP。
[0009] 上述技术方案所述的抗菌肽HP10,其中，所述抗菌肽HP10的分子量为1292. 4Da， 等电点为8. 79。
[0010] 上述技术方案所述的抗菌肽HP10在断奶仔猪料中的应用。
[0011] 抗菌肽HP10的制备方法，包括下述步骤：
[0012] (1)、通过FM0C保护合成法将氨基酸序列为HHHLHHIHKP的抗菌肽HP10从C端到 N端逐一进行激活和交联；
[0013](2)、步骤（1)的产物经HPLC反相柱层析脱盐纯化得到抗菌肽HP10。
[0014] 上述技术方案所述的制备方法制备所得的抗菌肽HP10在断奶仔猪料中的应用。
[0015] 本发明具有以下有益效果：
[0016] (1)、本发明中的抗菌肽HP10具有分子量小、人工合成方便、热稳定性强、杀菌作 用强、无耐药性等优点；
[0017] (2)、本发明中的抗菌肽HP10在仔猪饲料中应用具有能够显著改善仔猪肠道健 康、增强机体免疫力、提高仔猪生长性能的优点。
【附图说明】：
[0018] 1、图1为抗菌肽HP10对24日龄断奶仔猪腹泻率的影响。
【具体实施方式】：
[0019] 为使本发明的技术方案便于理解，以下结合具体实施例对抗菌肽HP10及其制备 方法和应用作进一步的说明，以下过程中均采用常规技术方法和仪器说明书内容进行操 作。
[0020] 实施例1 :抗菌妝HP 10的制备：
[0021]抗菌肽HP10是在天然抗菌肽PMAP36 (GRFRRLRKKTRKRLKKIGKVLKWIPPIVGSIPLGCG) 的基础上截取改造的，由于组氨酸是幼年动物一种必不可少的氨基酸，且它的抗菌活性比 精氨酸和赖氨酸强，所以用组氨酸替代精氨酸和赖氨酸。
[0022] 抗菌肽HP10的化学合成方法，包括下述步骤：
[0023](1)、按照抗菌肽HP10的氨基酸序列HHHLHHIHKP，通过FM0C保护合成法将抗菌肽 HP10从C端到N端逐一进行激活和交联，由上海吉尔（GL)生化有限公司用固相化学合成法 通过全自动多肽合成仪（ABI433)合成抗菌肽全序列；
[0024](2)、由上海吉尔（GL)生化有限公司对步骤⑴的产物用高效液相色谱（HPLC)反 相柱层析脱盐纯化；
[0025] 再利用电喷雾质谱法（采用美国Agilent公司的Agilent6520Q-T0F四级杆飞行 时间质谱仪）对抗菌肽加以鉴定，纯度大于95%;
[0026] 2、纯化的抗菌肽HP10分子量采用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱 (MALDI-T0F)测定，等电点使用等电聚焦电泳测定，氨基酸序列采用自动氨基酸序列测定仪 进行解析。
[0027] 抗菌肽HP10含10个氨基酸残基，分子量为1292. 4Da，等电点为8. 79,其氨基酸序 列为 HHHLHHIHKP。
[0028] 以下通过具体实验例来说明本发明抗菌肽HP10在断奶仔猪饲料中应用中所具有 的有益效果。
[0029] 实验例1 :抗菌妝HP10抑菌实验：
[0030](1)、试验菌株：大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、枯草芽孢杆 菌和巨大芽孢杆菌。
[0031] (2)、多肽母液（0.2%BSA+0.01%乙酸）：称取0.2g牛血清白蛋白（BSA)加入 80mLddH20水中混匀，再加入10 y L的乙酸溶液，然后用ddH20水定容至100mL，用0.22ym 孔径的滤膜过滤除菌后，4°C保存备用。
[0032]通过测定抗菌肽 HP10 最小抑菌浓度（minimal inhibitory concentration，MIC) 来反映其抗菌效果，最小抑菌浓度为检测不到细菌生长的最低样品浓度。将试验菌于37°C 过夜培养16h，再吸取100 y L过夜培养的菌液转接到新鲜MHB肉汤培养基中，培养2. 5~ 3h，直至菌体处于对数生长期，然后用lOmM磷酸钠缓冲液（pH 7.4)悬浮菌体细胞，并稀释 菌体，使其菌落数为106CFU/mL左右。96孔板的每排的第1号孔内加入90 y L 10mM磷酸钠 缓冲液（pH 7. 4)其它孔中加入50 y L缓冲液，第1号孔内再加入10 y L待测多肽母液，然后 将第1号孔中的多肽溶液吸出50 y L加入第2号孔内，依次类推，倍比稀释至第10号孔后， 吸出50 y L弃去；用加样器吸取上述调整好的50 y L菌体依次加到96孔板的前11个孔中， 使最终接种细菌浓度为每孔5 X 105CFU/mL。将96孔板置微型振荡器上振荡混匀，微孔板加 盖以减少孵育过程中的液体蒸发，于37°C下孵育2h。其中第11孔设定为阳性对照组：即只 加50 y L缓冲液和50 y L菌液；第12孔为阴性对照组：即只加100 y L缓冲液。此时从第1 孔到第10孔抗菌肽的浓度将依次递减；从每个孔中吸取50 iiL，连续稀释至10-1、10-2、和 10-3,分别取20 y L点样到MHA平板上的相应区域。平板在37°C下孵育8~10h后取出计 数。
[0033] 结果判断：阴性对照组在孵育结束后应未长菌，阳性对照菌生长良好。在一系列肽 浓度菌体计数中，未长菌的最小浓度肽的处理组为LC。试验重复操作三次。如表1所示。 从表中可以看出抗菌肽HP 10对大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、枯草 芽孢杆菌和巨大芽孢杆菌均有非常强的杀伤作用。
[0034] 表1抗菌肽HP10的最小杀菌浓度（y M)
[0035]
[0036]实验例2 :抗菌肽HP10对断奶仔猪生长性能、肠道健康和免疫功能的影响：
[0037] 选取21日龄运输后断奶仔猪320头，采用单因子试验设计，按体重和性别随机分 到如表2所示实验设计方案的4个处理组中，其中阴性对照组为基础日粮，HP10-50组为基 础日粮中添加50mg/kg抗菌肽HP10 ;HP10-100组为基础日粮中添加100mg/kg抗菌肽HP10， 阳性对照组为基础日粮中添加l〇〇mg/kg金霉素，每组10个重复，每个重复8头猪，试验期 14天。
[0038] 表2实验设计方案
[0039]
[0040] 抗菌肽HP10对断奶仔猪生产性能、腹泻率和免疫球蛋白的影响见表3、图1和表 4。从表3的实验结果可以看出抗菌肽HP10能够显著提高断奶仔猪的生长性能；从图1的 实验结果可以看出抗菌肽HP10可改善断奶仔猪肠道健康、降低断奶仔猪腹泻率；从表4的 实验结果可以看出抗菌肽HP10可提高仔猪的免疫球蛋白浓度，增强机体的免疫能力和抗 病能力。
[0041] 表3抗菌肽HP10对24日龄断奶仔猪生长性能的影响
[0042]
[0043] 表4抗菌肽HP10对24日龄断奶仔猪免疫球蛋白的影响（g/L)
[0044]
[0045] 以上所述，仅为本发明的较佳实施例，并非对本发明作任何形式上和实质上的限 制，凡熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明技术方案范围内，当可利用以上所揭示的技 术内容，而作出的些许更动、修饰与演变的等同变化，均为本发明的等效实施例；同时，凡依 据本发明的实质技术对以上实施例所作的任何等同变化的更动、修饰与演变，均仍属于本 发明的技术方案的范围内。
【主权项】
1. 抗菌肽HP10,其特征在于：所述抗菌肽HPlO的氨基酸序列为HHHLHHIHKP。2. 根据权利要求1所述的抗菌肽HP10,其特征在于：所述抗菌肽HPlO的分子量为 1292. 4Da，等电点为 8. 79。3. 根据权利要求1或2所述的抗菌肽HPlO在断奶仔猪料中的应用。4. 抗菌肽HPlO的制备方法，包括下述步骤： (1) 、通过FMOC保护合成法将氨基酸序列为HHHLHHIHKP的抗菌肽HPlO从C端到N端 逐一进行激活和交联； (2) 、步骤（1)的产物经HPLC反相柱层析脱盐纯化得到抗菌肽HP10。5. 根据权利要求4所述的制备方法制备所得的抗菌肽HPlO在断奶仔猪料中的应用。
【专利摘要】本发明抗菌肽HP10及其制备方法和应用，属于含5-20个氨基酸的肽合成技术领域以及化合物和药物制剂的特定治疗活性技术领域。所述抗菌肽HP10的氨基酸序列为HHHLHHIHKP；其分子量为1292.4Da，等电点为8.79。其制备包括下述步骤：(1)、通过FMOC保护合成法将氨基酸序列为HHHLHHIHKP的抗菌肽HP10从C端到N端逐一进行激活和交联；(2)、步骤(1)的产物经HPLC反相柱层析脱盐纯化得到抗菌肽HP10。本发明中的抗菌肽HP10具有分子量小、人工合成方便、热稳定性强、杀菌作用强、无耐药性等优点；还具有在仔猪饲料中应用还具有能够显著改善仔猪肠道健康、增强机体免疫力、提高仔猪生长性能的优点。
【IPC分类】C07K7/06, A23K1/18, A23K1/16, C07K1/20, C07K1/10, C07K1/06
【公开号】CN105153281
【申请号】CN201510600706
【发明人】姜文, 周盛昌, 苏斌朝, 施建成, 肖丽萍, 叶俊标
【申请人】广州傲农生物科技有限公司
【公开日】2015年12月16日
【申请日】2015年9月18日