玉米浆 0.6%，CaClzO. 5%，调节抑至 4. 5,121-123°C灭菌 30-40min.
[0057] 实施例3酸性蛋白酶的酶活测定方法
[0058] (1)酶活单位定义：1血液体酶在40°C，抑值为3. 0的条件下，Imin水解酪素产生 1yg酪氨酸为一个酶活力单位，Wu/mL计。
[0059] 似原理：蛋白酶在一定溫度和抑条件下，水解酪素（哺乳类为幼子生长提供氮 源的一种蛋白质）底物，产生含有酪基的氨基酸[如：酪氨酸（a-氨基-P-对径苯基丙 酸），色氨酸（a氨基-P-吗I噪基丙酸）等]，在碱性条件下，将福林试剂还原，生成銷蓝和 鹤蓝，用分光光度计测定吸光度，计算其酶活力。 柳6〇]0)试剂和溶液
[0061] 福林试剂的制备：于2000mL磨口回流装置中加入鹤酸钢（Na2W〇4?S&O)lOOg，钢酸 钢（胞210〇4.2&0)25邑，水700血，85%憐酸50血，浓盐酸100血，小火沸腾1011，取下回流冷 却器，在通风楓中加入硫酸裡化iS04)50g，水50血和数滴浓漠水（99% )，再微沸15min，W 除去多余的漠（冷后仍有绿色再加漠水，再微沸除去过量的漠），冷却，加水定容至lOOOmL， 混匀，过滤。制得的试剂应呈金黄色，胆存于栋色瓶中。
[0062] 使用溶液：一份福林试剂与二份水混合，摇匀。
[0063] 碳酸钢溶液[C(NazCOs) =0.4mol/L]:取无水碳酸钢42. 4g，用水溶解并定容至 1000血D
[0064] S氯乙酸[c(CCL3-C00H)]二0.4mol/L:取S氯乙酸65.4g，用水溶解并定容至 1000血D 阳0化]氨氧化钢溶液[C= 0. 5mol/L]:按GB601配制。
[0066] 盐酸溶液[C=Imol/L及 0.Imol/L]
[0067] GB601 :量取90血盐酸，注入1000血水中，摇匀，即得Imol/L盐酸。 W側量取9血盐酸，注入1000血水中，摇匀，即得0.Imol/L盐酸。
[0069] 憐酸缓冲液（pH= 7. 5):称取憐酸氨二钢（化甜P04 ? 12肥0) 6. 02g和憐酸二氨钢 (N址2P04 ? 2肥0)0. 5g，加水溶解并定容至1000血，须用抑计校正。
[0070]lOg/L酪素（酪蛋白）溶液：称取酪素1.OOOg，精确至0.0 Olg，用浓乳酸2~3滴 湿润后，加入抑7. 5的缓冲液约80mU在沸水浴中边加热边揽拌，直至完全溶解，冷却后，转 入lOOmL的容量瓶中，用缓冲液稀释至刻度。此溶液在冰箱内胆存，有效期3天。
[0071] 心酪氨酸标准溶液：
[0072] a.称取预先于105°C干燥至恒重的k酪氨酸0.lOOOg，精确至0. 0002g，用Imol/ 阳07引 L盐酸60血溶解后定容至lOOmL，即为Img/mL酪氨酸标准溶液。
[0074]b.吸取Img/mL酪氨酸标准溶液10. 00血，用0.Imol/L盐酸定容至100血，即得到lOOug/mk酪氨酸标准溶液。
[00巧](4)仪器和设备
[0076] 恒溫水浴锅：40 ± 0. 2°C
[0077] 分光光度计：应符合GB9721的规定 阳〇7引 妨分析步骤 阳079] 标准曲线的绘制
[0080] 分别吸取lOOmg/mlL_酪氨酸标准液 0、1. 0、2. 0、3. 0、4. 0、5. 0、6. 0ml于 10ml 容量瓶中，用蒸馈水定容至刻度，制成每ml分别含L-酪氨酸0、10、20、30、40、50、60mg 的稀标准液。各取上述溶液1. 00ml(须做平行试验）于试管中，加入0. 4mol/L碳酸钢溶 液5. 00ml，稀福林试剂1. 00ml，置于40°C水浴中显色20min，取出用10mm比色皿，在波长 660nm处用分光光度计分别测定其吸光度，其中不含酪氨酸的管为空白对照。W吸光度为纵 坐标，相应的酪氨酸浓度为横坐标，绘制标准曲线或计算回归方程。当吸光度为1时的酪氨 酸量（mg)即为比色常数K值。
[0081] (6)待测酶液的制备
[0082] 比色测定：精确吸取待测酶液1. 0ml(每个样品3支平行试管），40°C水浴预热 2min。同时取适量1%酪素溶液在40°C水浴预热3~5min，然后取其1. 0ml，加入到经预热 的上述酶液中，立即开始计时，于40°C水浴精确反应lOmin，立即加入2.OmlO. 4mol/LS氯 乙酸，摇匀，取出静置lOmin，过滤，取滤液1. 0ml。加入0. 4mol/L碳酸钢溶液5. 0ml，W后按 标准曲线绘制步骤测定样品吸光度。 阳08引同时进行空白对照测定，其步骤为吸取待测酶液1. 0ml，4(TC水浴2min后加入 2. 0ml0. 4mol/LS氯乙酸，40°C水浴lOmin，然后加入1%酪素溶液1. 0ml，取出静置lOmin， 过滤，取滤液1. 0ml，W后步骤同于样品测定。
[0084] (7)计算 阳0 化]X= (AXKX4Xn)/(lX10)
[0086] 式中：X-样品的酶活力，u/g;
[0087] A-样品平行试验的平均吸光度； 阳0蝴K-比色常数；
[0089] 4 -反应试剂体积（ml);
[0090] n-样品稀释倍数； 阳091] 1 -参与反应的酶液量，ml;
[0092] 10-反应时间，min
[0093] 实施例4酶的最适作用抑范围
[0094]W本发明所产的酶活力20000u/mL的酸性蛋白酶为基准，在40°C条件下，分别在 不同抑值化0、2. 5、3. 0、3. 5、4. 0、4. 5)下，测定酶活力，测定的相对酶活力变化曲线如图 1所示，酶的最适作用抑范围为2. 5-3. 5。 阳0巧]实施例5酶的最适作用溫度范围
[0096]W酶活力20000u/mL的酸性蛋白酶为基准，在抑值为3. 0条件下，分别在不同溫 度（45、50、55、60、65、70、75)下，测定酶活力，测定的相对酶活力变化曲线如图2所示，酶的 最适作用溫度范围为55°C-65°C。
[0097] 实施例6酶的热稳定性
[0098]W酶活力20000u/mL的酸性蛋白酶为基准，在抑值为3. 0条件下，80°C下保溫 0-化测定剩余酶活力，如图3所示，80°C保溫化后剩余酶活为58. 4%，具有良好的耐热保 存活性。
【主权项】
1. 一株高产酸性蛋白酶的黑曲霉突变菌株，其特征在于，所述菌株具体为黑曲霉 (Aspergillusniger)TP-235,菌株保藏号为CGMCC10789。2. 如权利要求1所述的一株高产酸性蛋白酶的黑曲霉突变菌株，其特征在于，所述菌 株液体发酵平均产酸性蛋白酶活为21800u/mL-21900u/ml。3. 如权利要求1所述的一株高产酸性蛋白酶的黑曲霉突变菌株，其特征在于，所述菌 株液体发酵产酸性蛋白酶最适作用pH范围为2. 5-3. 5,最适作用温度范围为55°C-65°C。4. 如权利要求1所述的一株高产酸性蛋白酶的黑曲霉突变菌株，其特征在于，所述菌 株液体发酵产酸性蛋白酶在60°C保温Ih后剩余酶活为78%，80°C保温2h后剩余酶活为 58. 4% 〇5. 利用权利要求1所述黑曲霉突变菌株液体发酵产酸性蛋白酶的方法，其特征在于， 包括以下步骤： 斜面培养：将所述黑曲霉突变株TP-235取一接种环菌苔接种于PDA斜面培养基，30°C下恒温培养72h; 摇瓶培养：将斜面培养得到的菌株取一接种环菌苔接入种子培养基中，在初始pH4. 5-5. 5、30°C、摇床转速200rpm条件下培养72h; 种子罐培养：将摇瓶发酵后的种子液按照接种量5%的比例接入种子罐培养基，在初 始pH4. 5-5. 5、30°C、转速 200-800rpm条件下培养 48h; 发酵罐培养：将种子罐中的种子液按照接种量5 %的比例接入发酵罐培养基，培养条 件为初始口^14.5-5.5、30°(：、风量0-24110.25￥￥111、24-48110.5￥￥111、4811-放罐1.(^￥111、转速 200-800rpm，发酵期间当pH低于4. 5时，开始不断添加补料培养基来控制pH在4. 5-5. 5的 范围内，当酶活增长缓慢，菌体自溶严重时结束发酵，发酵周期为100_120h; 所述酸性蛋白酶的提取与精制方法如下： 向上述发酵液中加入3%珍珠岩助滤剂，进行板框压滤；用超滤膜对澄清压滤酶液进 行超滤浓缩；在浓缩液中加入稳定剂、防腐剂，然后用硅藻土进行过滤除菌，即得到酸性蛋 白酶成品酶制剂。6. 如权利要求5所述的黑曲霉突变菌株液体发酵产酸性蛋白酶的方法，其特征在于， 所述斜面培养基如下：蔗糖 25g，NaNO3 2g，MgSO4 0? 5g，KCl0? 5g，FeSO4 0?Olg，K2HPO4 lg，琼脂20g，将上述各组分溶于1000 mL水中，调节pH至4.5, 121°C灭菌20min，备用； 所述种子培养基如下：麦芽汁150mL，琼脂3g，调节pH至4. 5, 121°C灭菌20min，备用； 所述种子罐培养基质量体积比组成为：麸皮5%，KH2PO4 0. 15%，CaCl2 0.005%，调节pH至 4. 5, 121-123°C灭菌 30-40min; 所述发酵罐培养基质量体积比组成为：玉米粉5 %，豆饼粉4 %，硫酸铵1 %，KH2PO4 0? 3%，玉米浆 0? 6%，CaCl2 0? 5%，调节 pH 至 4. 5, 121-123°C灭菌 30-40min ; 所述补料瓶培养基质量体积比为：玉米淀粉10%，硫酸铵1%，KH2PO4 0. 1%，玉米浆 0? 6%，CaCl2 0? 5%，调节pH至 4. 5, 121-123°C灭菌 30-40min。
【专利摘要】本发明公布了一株高产酸性蛋白酶的黑曲霉突变株及其液体发酵方法，所述黑曲霉突变菌株为黑曲霉(Aspergillus？niger)TP-235，保藏编号为CGMCC？10789，该菌株通过液体深层发酵在50L发酵罐上经补料发酵培养100-120h，产酶水平为21852u/mL。本发明建立的液态发酵酸性蛋白酶的方法，生产的酸性蛋白酶最适pH范围为2.5-3.5，最适作用温度范围为55℃-65℃，在60℃保温1h后剩余酶活为78％，80℃保温2h后剩余酶活为58.4％，具有良好的耐酸性和耐热性，可广泛应用于酿酒、食品、饲料以及皮革加工等行业。CGMCC No.1078920150507
【IPC分类】C12N1/14, C12R1/685, C12N9/62
【公开号】CN105199969
【申请号】CN201510677600
【发明人】王兴吉, 韩龙, 张 杰
【申请人】山东隆科特酶制剂有限公司
【公开日】2015年12月30日
【申请日】2015年10月19日