樟芝固态培养菌丝体的萃取物及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明有关于一种棒芝固态培养菌丝体的萃取物，同时还关于该棒芝固态培养菌 丝体的萃取物在制备抗肺癌细胞转移药物中的应用。
【背景技术】
[0002] 肿瘤的生成会经由个人的行为、年龄、饮食、生活习惯、遗传W及环境所造成，根据 卫生署的数据显示，恶性肿瘤依然为十大死亡原因之首，而通常导致癌症病人致死的原因， 都是因为肿瘤的转移，所W，如何能有效地控制肿瘤细胞并且抑制其转移，对治疗癌症是非 常重要的策略之一。
[0003] 棒芝(Antrodiacinnamomea；Syn.AntrodiacamphorataandTaiwanofungus cam地orata)是非常珍贵的药用真菌。在许多科学研究中已证实，棒芝菌丝体的甲醇抽出物 与热水萃取物、子实体的甲醇萃取物、己醇萃取物与己酸己醋萃取物具有优异的抗发炎活 性，而也有部分研究指出棒芝的菌丝体与子实体含有一些环焼类的化合物，该些化合物具 有抗癌的能力，然而关于棒芝及其所含的环焼类化合物参与抗癌转移的作用机制与生理活 性，仍有待更进一步的了解。故，一般无法符合使用者于实际使用时所需。
【发明内容】
[0004] 本发明的主要目的在于，克服已知技术所遭遇的上述问题并提供一种棒芝固态培 养菌丝体的萃取物及其应用，该萃取物可抑制肺癌肿瘤转移的产生，而展现优异的抗癌转 移。
[0005]为达W上目的，本发明所采用的技术方案是：一种棒芝固态培养菌丝体的萃取物， 该萃取物按W下列步骤获取：
[0006] (Al)提供一干燥的棒芝固态培养菌丝体；
[0007] 度1)将该干燥的棒芝固态培养菌丝体于25-4(TC下W10倍体积的95%体积浓度 的己醇萃取。
[0008]本发明采用的另一种技术方案是；一种棒芝固态培养菌丝体的萃取物，该萃取物 按下列步骤获取：
[0009] (A2)提供一干燥的棒芝固态培养菌丝体；
[0010] 度2)将该干燥的棒芝固态培养菌丝体于25-4(TC下W10倍体积的95%体积浓度 的己醇萃取W获得一己醇萃取物；
[0011] (C2)真空浓缩该己醇萃取物W获得一浓缩产物；
[0012] 值2)利用100%体积浓度的己酸己醋与水将该浓缩产物分层化W获得一己酸己 醋萃取物。
[0013] 上述干燥棒芝固态培养菌丝体的干燥方式为冷风干燥。
[0014] 本发明同时提供上述提及的萃取物在制备抗肺癌细胞转移药物中的应用。所述萃 取物通过抑制肺癌细胞移行作用或侵袭作用W抗肺癌细胞转移。
[0015] 所述萃取物通过降低磯酸化丝氨酸激酶、基质金属蛋白酶中的明胶分解酶、及增 加巧黏附分子E、金属蛋白酶抑制剂的表现W抑制该肺癌细胞的移行作用与侵袭作用。
[0016] 本发明提及的上述萃取物的分子为2, 3, 6-Trimetho巧-4-methylphenol，其结构 式如下：
[0017]
[0018] 本发明还提供一种抗肺癌细胞转移的方法，是使受测对象与上述的萃取物或 2, 3,G-Trimethoxy-A-meth}^地enol接触。
[0019] 综上述，本发明的棒芝固态培养菌丝体的萃取物具有抗肺癌细胞转移的功效，更 明确地，本发明掲露棒芝固态培养菌丝体的萃取物于抗肺癌细胞转移的生理活性与作用机 制，可制备成抗肺癌细胞转移药物。
【附图说明】
[0020] 图1是本发明棒芝固态培养菌丝体的萃取物Leaderl示意图。
[0021] 图2是本发明棒芝固态培养菌丝体的萃取物Leaderl影响肺癌细胞的细胞存活率 示意图。
[0022] 图3是本发明棒芝固态培养菌丝体的萃取物Leaderl影响肺癌细胞的细胞伤口愈 合能力的表现量W意图。
[0023] 图4A及图4是本发明棒芝固态培养菌丝体的萃取物Leaderl影响肺癌细胞的细 胞移行能力的表现量示意图。
[0024] 图5是本发明棒芝固态培养菌丝体的萃取物Leaderl影响肺癌细胞的细胞侵袭能 力的表现量示意图。
[0025] 图6A及图6B是本发明棒芝固态培养菌丝体的萃取物Leaderl影响肺癌细胞的基 质金属蛋白酶（MMP-2、MMP-9)的表现量示意图。
[0026] 图7是本发明棒芝固态培养菌丝体的萃取物Leaderl影响肺癌细胞中纤溶酶原激 活物的能力的表现量示意图。
[0027] 图8A及图8B是本发明棒芝固态培养菌丝体的萃取物Leaderl影响肺癌细胞转移 的相关蛋白酶及蛋白表现能力的表现量示意图。
【具体实施方式】
[0028] 本发明是关于一种棒芝固态培养菌丝体的萃取物及其应用，该萃取物抑制肺 癌细胞转移的产生，而展现优异的抗癌转移功能。该棒芝固态培养菌丝体的萃取物为 2, 3, 6-T;rimetho:xy-4-methylphenol，又称利得I号（Xeaderl)。
[0029] 癌细胞转移的过程，包括了细胞的黏附（a化esion)、侵入（invasion)W及迁移 (migration)。癌细胞的转移需要基质金属蛋白酶（matrixmetallop;roteinases,MMP) 来分解细胞外基质巧xtracelIutarMatrix,ECM)，并且产生上皮-间质细胞转换 巧pithelial-MesenchymalTransition,EMT);同时癌细胞转移相关的蛋白会大量地表现， 促使癌细胞转移的发生。
[0030] 肿瘤坏死基因（Tumornecrosis化Ctor,TNF)是由巨瞻细胞分泌的一种小分子蛋 白（C^okine)D其中肿瘤坏死基因-a(TNF-Q)主要由单核-巨瞻细胞分泌。许多先前的 研究中指出TNF-Q会促进肺癌细胞的浸润及转移。据此，当运用时，本发明是WTNF-Q诱 导A549肺癌细胞W做为本发明于棒芝固态培养菌丝体参与抗肺癌细胞转移的角色探讨的 模型。
[0031] W下实施例仅举例W供了解本发明的细节与内涵，但不用于限制本发明的申请专 利范围。
[003引实施例1 ;实验设计
[0033] [材料]
[0034] 本发明所用的棒芝固态培养菌丝体是由中国台湾利得生物科技公司自行培养 的菌丝体。胎牛血清（FetalBovineSerum,FB巧购自GibcoBI^LQnvitrogen,Grand Island,NY)。二甲基亚讽值imethylsulfoxide,DMSO)、盘尼西林（penicillin)、喔哇藍 漠化四哇（3-(4, 5-dimeth}dthiaz〇]_-2-;yl)-2, 5-di地en}dtetrazoliumbromide,MTT)、 吉姆萨（Gimsa)、及酪蛋白（Casein)皆购自Sigma-Al化ich(StLouis,MO)。本发明 所用的所有化学药品及溶剂皆为试剂或高效能液相层析化i曲PerhrmanceLiquid Qiromatogra地y,HPLC)等级。
[00对[细胞培养]
[0036] 本发明选用人类肺癌肿瘤A549细胞W进行肿瘤细胞转移实验探讨。关于A549细 胞的培养，是首先将生长于培养瓶（75TFlask)的A549细胞，W2X105cells/cm2的接种密 度改种于IOcm2培养盘（dish)中，并培养于37°C，5% 0)2培养箱（incubator)中。所使用的 培养液是依据生物资源保存中必炬ioresourcesCollectionandResearchCenter,BCRC) 与美国菌种中必（AmericanTypeQiltureCollection,ATCC)的建议选用Ham'sF12 培养 液，并外加10%的胎牛血清。
[0037] 实施例2 ;本发明的棒芝固态培养菌丝体的萃取物Leaderl的制备
[0038] 首先将棒芝固态培养菌丝体W冷风干燥方式干燥，接着在25C下将2000克前述 经冷风干燥的棒芝固态培养菌丝体W10倍体积的95%体积百分比（v/v)的己醇萃取，W得 本发明的己醇萃取物（ACME)。前述干燥方式可选用所属领域已知的任何干燥方式，而无须 加W限定，如冷风干燥。
[0039] 接着将该己醇萃取物于真空下（invac州m)浓缩W获得323. 6公克的浓缩产物。 所得浓缩产物接着W100% (v/v)的己酸己醋与水分层为己酸己醋分离部与水溶性层，其 中该水溶性层系标记为水溶性分离部（ACME-water)，而该己酸己醋分离部即为本发明的己 酸己醋萃取物（ACME-EA)。
[0040] 实施例3 ;Leade;rl的分离
[0041] 将上述实施例2中所得的己酸己醋萃取物（ACME-EA)W管柱层析法（COIumn C虹omatography)经流动相的浓度梯度中划分为9个次分离部。其中，该管柱层析法所使 用的固定相为硅胶（230~400mesh)，流动相为正己焼/己酸己醋混合液；该浓度梯度是指 依序W正