异。
[0069] 实施例9;实施例2的棒芝固态培养菌丝体的萃取物Leaderl抑制肺癌细胞（肺 癌细胞株A549)纤溶酶原激活物能力的测试
[0070] W电泳方式对水解酶进行检测，使用酪蛋白酶谱法（Casein-zymography)中含有 纤溶酶原（plasminogen)来分析在肺癌细胞中尿激酶型纤溶酶原激活物（urokinase-type plasminogenactivator,uPA)的酵素活性，尿激酶型纤溶酶原激活物会将纤溶酶原分解成 纤溶酶（plasmin)。
[0071] 首先A549肺癌细胞系依据上述实施例1所述的细胞培养方法培养，W膜蛋白酶拆 下后，将细胞W2xl05cells/cm2的接种密度至12孔盘中24小时使细胞贴附，接着用PBS润 洗两次，加入含有不同浓度的0、5、10、20及40UM的Leaderl的培养基24小时后，置换成含 有1 %胎牛血清的培养基24小时，取得与细胞培养的培养液，放入微量离必管中W1250rpm 离必10分钟，取上清液保存于-2(TC。
[0072] 将等量的上清液混合物加入6倍基质金属蛋白酶染剂至8%梯度电泳胶体孔内 (含有纤溶酶原15U1/ml与酪蛋白Img/ml)，加入跑胶缓冲液W80V，300mA分离至45kD的 基质金属蛋白酶标记到胶的中间时即停止作用。
[0073] 将胶取下在酶谱复性缓冲液中作用于35rpm，并W室温下作用两次，每次30分钟， 待移除其中的SDS后，W酶谱显影缓冲液作用于35rpm、37°C下20-24小时后移除，利用考马 斯亮藍染色30分钟，W二次水浸泡到隔天，然后将胶置入数字影像分析仪受测物版上照相 分析并用sigmaplotlO. 0进行统计作图。
[0074] 请参阅图7所示，是本发明的棒芝固态培养菌丝体的萃取物Leaderl影响肺癌细 胞中纤溶酶原激活物的能力的表现量示意图。如图所示：由实施例2所得的棒芝固态培 养菌丝体的萃取物Leaderl展现了抑制促进肺癌细胞中纤溶酶原激活物的能力，尤其在 40UM的浓度下更显优异。
[00巧]实施例10 ;实施例2的棒芝固态培养菌丝体的萃取物Leaderl调控肺癌细胞（肺 癌细胞株A549)转移的相关蛋白表现的测试
[0076] 取得细胞的全蛋白（totalprotein)后，将等量的蛋白质加入8-10%梯度电泳胶 体孔内，W80V、300mA分离240分钟，将已依大小分开的蛋白质W100V，2小时为条件，转溃 至聚偏二氣己帰膜（polyvin^idenedifluoride,PVD巧上后，将二氣己帰膜W隔绝缓冲液 化lockingbuffer)作用1小时。其中，该隔绝缓冲液包含10%w/v脱脂奶粉于TBS-T缓 冲液中，且该TBS-T缓冲液含有0. 1 %的Tween20的TBS缓冲液。
[OOW] 接着将二氣己帰膜浸泡于肌动蛋白的抗体溶液（actin;Cellsignaling)、磯酸化 丝氨酸激酶的抗体溶液（p-Akt或proteinkinaseB;1:1000,Cellsi即aling)、巧黏附 分子E(E-ca化erin;1:1000,Cellsi即aling)、基质金属蛋白酶中的明胶分解酶的抗体溶 液（MMP-2, 9 ;1:1000,SantaCruz)、W及金属蛋白酶抑制剂的抗体溶液灯IMP-I;1:1000， 〔61131即曰1111扣，于4^中反应12-24小时后，回收抗体溶液放回-20^冰箱，再^0.1%的 TBS-T缓冲液清洗3次，W洗除非专一'性（non-specific)结合的抗体抗原。
[0078] 然后将二氣己帰膜浸泡于带有山葵过氧化酶化orseradishperoxidase)的 抗老鼠二级抗体溶液（anti-mousesecondaryantibodies)、抗兔子二级抗体溶液 (anti-r油bitsecondaryantibodies),于室温中反应1-2小时后，回收抗体溶液，Wo. 1% 的TBS-T缓冲液清洗3次，再W化学冷光试剂巧nhancedchemiluminesceneregents,E化） 侦测各组英光强度，并W目-肌动蛋白（目-actin)的表现量作为蛋白的控制对照组，并用 sigmaplotl化0进行统计作图。
[0079] 请参阅图8A及图8B所示，是本发明的棒芝固态培养菌丝体的萃取物Leaderl影 响肺癌细胞转移的相关蛋白酶及蛋白表现的能力的表现量W意图。如图所W;由实施例2 所得的棒芝固态培养菌丝体的萃取物Leaded展现了抑制促进肺癌细胞转移的相关蛋白 酶表现的能力，并促进了抑制肺癌细胞转移的相关蛋白表现的能力，具有显着的差异性。
[0080] 藉此，本发明提供关于棒芝固态培养菌丝体的萃取物及其应用，该棒芝固态培养 菌丝体的萃取物为2, 3,G-Trimetho巧-4-methylphenol(Leaderl)，该Leaderl能有效抑制 肺癌肿瘤细胞的运动、迁徙及侵袭的能力，进而达到抗肺癌细胞转移的效果，可展现优异的 抗肺癌细胞转移的生理活性与作用机制。综上所述，本发明的一种棒芝固态培养菌丝体的 萃取物及其应用，可有效改善现有技术中种种缺点，该棒芝固态培养菌丝体的萃取物为2, 3 ，e-himetho巧-4-methylphenol(Leaderl)，能有效抑制肺癌肿瘤细胞的运动、迁徙及侵袭 的能力，W达到抗肺癌细胞转移的效果，可展现优异的抗肺癌细胞转移的生理活性与作用 机制，进而使本发明的产生能更进步、更实用、更符合使用者所须，确已符合发明专利申请 的要件，依法提出专利申请。
[0081] 惟W上所述，仅为本发明的较佳实施例而已，当不能W此限定本发明实施的范围。 故，凡依本发明申请专利范围及发明说明书内容所作的简单的等效变化与修饰，皆应仍属 本发明专利涵盖的范围内。
【主权项】
1. 一种棒芝固态培养菌丝体的萃取物，其特征在于，该萃取物按w下列步骤获取： (A1)提供一干燥的棒芝固态培养菌丝体； 度1)将该干燥的棒芝固态培养菌丝体于25-4(TC下W 10倍体积的95%体积浓度的己 醇萃取。2. 如权利要求1所述的棒芝固态培养菌丝体的萃取物，其特征在于，所述干燥方式为 冷风干燥。3. -种棒芝固态培养菌丝体的萃取物，其特征在于，该萃取物按下列步骤获取： (A2)提供一干燥的棒芝固态培养菌丝体； 度2)将该干燥的棒芝固态培养菌丝体于25-4(TC下W 10倍体积的95%体积浓度的己 醇萃取W获得一己醇萃取物； (C2)真空浓缩该己醇萃取物W获得一浓缩产物； 值2)利用100%体积浓度的己酸己醋与水将该浓缩产物分层化W获得一己酸己醋萃 取物。4.如权利要求3所述的棒芝固态培养菌丝体的萃取物，其特征在于，所述干燥方式为 冷风干燥。5.如上述任一项权利要求所述的萃取物在制备抗肺癌细胞转移药物中的应用。6. 如权利要求5所述的应用，其特征在于，于细胞实验中，所述萃取物通过抑制肺癌细 胞移行作用W抗肺癌细胞转移。7.如权利要求5所述的应用，其特征在于，于细胞实验中，所述萃取物通过抑制肺癌细 胞侵袭作用W抗肺癌细胞转移。8. 如权利要求5所述的应用，其特征在于，于细胞实验中，所述萃取物通过降低磯酸化 丝氨酸激酶、基质金属蛋白酶中的明胶分解酶、及增加巧黏附分子E、金属蛋白酶抑制剂的 表现W抑制该肺癌细胞的移行作用与侵袭作用。9. 一种2, 3, 6-T;rimethoxy-4-methylphenol在制备抗肺癌细胞转移药物中的应用，其 为权利要求1-4中任一项所述的萃取物，并具有下列结构式：10. 如权利要求9所述的应用，其特征在于，于细胞实验中，所述抗肺癌细胞转移为萃 取物抑制肺癌细胞移行作用及侵袭作用。11. 如权利要求9所述的应用，其特征在于，于细胞实验中，所述 2, 3, 6-T;rimethoxy-4-methylphenol具有降低磯酸化丝氨酸激酶、基质金属蛋白酶中的明 胶分解酶、及增加巧黏附分子E、金属蛋白酶抑制剂的表现。12. -种于细胞实验中抗肺癌细胞转移的方法，是使受测对象与权利要求1-4中任一 项所述的萃取物或1，2, 4-Trimetho巧-6-methy化enzene-3-ol接触。
【专利摘要】一种樟芝固态培养菌丝体的萃取物及其在制备抗肺癌细胞转移药物中的应用，该樟芝固态培养菌丝体的萃取物为2,3,6-Trimethoxy-4-methylphenol，又称利得1号(Leader1)，该Leader1能有效抑制肺癌肿瘤细胞的运动、迁徙及侵袭的能力，进而达到抗肺癌细胞转移的效果，可展现优异的抗肺癌细胞转移的生理活性与作用机制。
【IPC分类】A61P11/00, C07C43/23, A61K31/09, C07C41/38, A61P35/04
【公开号】CN105237365
【申请号】CN201410324384
【发明人】林进忠, 郭钟达, 陈静君, 李政暾, 林宇彦
【申请人】台湾利得生物科技股份有限公司
【公开日】2016年1月13日
【申请日】2014年7月9日