TGTCTCAGAACTCCGATTGCGAAGGCAGCTGTCTAAACGGTGATTGACGCTGATGCACGAAAGCGTGGGGATCGA
ACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCCTAAACGATGATGACTCGATGTTTGCGATATACGGTAAGCGTCCAAG
CGAAAGCGTTAAGTCATCCACCTGGGGAGTACGCCCGCAAGGGTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAA
GCGGAGGAGCATGTGGTTTAATTCGATGATACGCGAGGAACCTTACCCGGGCTTGAAAGTTACTGAATGGTCCAGAG
ATGGGCCAGTCCTTCGGGACAGGAAACTAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGCCGTGAGGTGTTGGGTTAAG
TCCCGCAACGAGCGCAACCCCTATGTTTAGTTGCCAGCATTTAAGGTGGGGACTCTAAACAGACTGCCCGTGCAAAC
GGTGAGGAAGGCGGGGACGACGTCAAGTCATCATGGCCCTTACGTCCGGGGCTACACACGTGCTACAATGGATGGTACAACGGGCAGCTACACAGCAATGTGATGCCAATCTCTAAAAGCCATTCACAGTTCGGATCGGGGTCTGCAACTCGAC
CCCGTGAAGTTGGATTCGCTAGTAATCGCGTATCAGCAATGACGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCG
CCCGTCAACCCATTA
基于16S rRNA基因构建的系统发育树可以看出Sphingobacterium griseoflavusSQJ-B140 与鞘氨醇杆菌属的一个有效种 Sphingobacterium bambusae IBFC2009 聚为一个分支，该菌Sphingobacterium griseoflavus SQJ-B140与亲缘性最近的菌株Sphingobacterium bambusae IBFC2009 的 16S rRNA 基因序列相似度为 97.49%，结合表型、生理生化和基因型比较数据，表明菌Sphingobacterium griseoflavus SQJ-B140为鞘氨醇杆菌属的一个新种。
[0014]通过实施本发明的具体技术指标，可达到以下预期效果。
[0015].本发吸饱Sphingobacterium griseoflavus SQJ-B140 为好氧菌，革兰氏阴性，菌落呈灰黄色。氧化酶和过氧化氢酶阳性。pH生长范围为6至9，最适生长盐浓度为0.5%至1%。该菌具有碱性磷酸酶、酯酶(C4)、脂肪酶(C8)、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶和N-乙酰-葡萄糖胺酶等酶活性，可广泛地应用在农药降解酶的开发和各类生物工程酶制剂的生产领域。
[0016]【附图说明】:图1 是菌株 Sphingobacterium griseoflavus SCU-B140 扫描电子显微镜50000倍下照片。
[0017]下面举实施例说明本发明，但是本发明并不限于下述实施例。
[0018]具体实施方法
实施例一 ?.Sphingobacterium griseoflavus SCU-B140的筛选和分离实验用幡蟀样品为乌头眉纹幡蟀(teleogryllus occipitalis)的成虫，多分布于农田，于2012年8月份分批次捕捉自四川省成都市双流县四川大学江安校区荒地(30° 33’38.04”北104° 00’ 20.17”东，海拔481米)。用无菌水将微生物从蟋蟀洗脱后，采用稀释平板法涂布至TSB、查氏、高氏一号、PDA、牛肉膏蛋白胨和虫体无机盐培养基上培养，37°C下培养至可见菌落出现，纯化菌落后进行鉴定。
[0019]菌种描述:
好氧菌，革兰氏阴性，菌落呈灰黄色。氧化酶和过氧化氢酶阳性。pH生长范围为6至9，最适生长盐浓度为0.5%至1%。该菌具有碱性磷酸酶、酯酶(C4)、脂肪酶(C8)、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶和N-乙酰-葡萄糖胺酶等酶活性，细胞主要脂肪酸为iso-C15:。，summedfeature 3 (iso_C15:。2-0H and/or C16:1 ω 7c)和 C16:。，主要呼吸醌为 MK-7，主要极性脂为磷脂酰乙醇胺(PE)，细胞内G+C含量为41.22%。
[0020]实施例二??Sphingobacterium griseoflavus SCU-B140的多相分类鉴定
对该菌株Sphingobacterium griseoflavus SQJ-B140的碳源利用情况采用B1log全自动细菌鉴定系统，脂肪酸成分测定采用GC-MS分析，酶学特性采用API ZYM试剂条鉴定，产酸实验采用API50CHE试剂条鉴定，参考菌株为Sphingobacterium bambusae IBFC2009。结果如下:
可利用碳源:糊精、吐温40、吐温80、N-乙酰基-D-半乳糖苷、L-阿拉伯糖、D-纤维二糖、D-果糖、D-半乳糖、龙胆二糖、D-乳糖、乳果糖、麦芽糖、D-甘露糖、D-蜜二糖、β -甲基-D-葡萄糖苷、D-棉子糖、L-棉子糖、蔗糖、D-海藻糖、松二糖、乙酸、甘氨酰-L-谷氨酸、L-丝氨酸、L-苏氨酸。
[0021]具有的酶活性:碱性磷酸盐酶、酯酶(C4)、类脂酯酶(C8)、类脂酶(C14)、白氨酸芳胺酶、缬氨酸芳胺酶、胱氨酸芳胺酶、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、酸性磷酸酶、萘酚-AS-ΒΙ-磷酸水解酶、α -半乳糖甙酶、β -半乳糖甙酶、β -糖醛酸甙酶、α -葡萄糖甙酶、β -葡萄糖甙酶、Ν-乙酰-葡萄糖胺酶。
[0022]API50CHE 鉴定结果对比:从 API50 CHE 结果来看，菌株 Sphingobacteriumgriseoflavus SCU-B140 和最亲近菌种 Sphingobacterium bambusae IBFC2009 共有 16 种底物利用不同，结合进化树数据判断该菌为鞘氨醇菌属的一个新种。
[0023]实施例三:16S rRNA基因测序及进化树构建
采用SDS法提取细菌总DNA，通过PCR法扩增菌株16S rRNA基因序列，DNA测序由上海生工生物工程技术服务有限公司完成。到GenBank (http://www.ncb1.nlm.nih.gov/)数据库将各菌株测得的16S rRNA基因部分序列提交注册获得序列号。再在NCBI (Nat1nalCenter for B1technology Informat1n)上进行BLAST比对，找到亲缘关系最近的菌株。通过B1Edit将亲缘性最近的相应菌株进行序列比对，然后在软件MEGA 5.2上使用Neighbor-Joinin(N-J)法构建系统进化树。PCR相应引物、反应体系、条件如下:引物27F:5’-GAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’ 和 1492R: 5’ -ACGGCTACCTTGTTACGACTT-3’，反应体系(25 yL 体系):Mg2+2.5 yL，27F 2.5 yL, 1492R 2.5 μ L, dNTP 0.75 μ L，H20 14 μ L，Taq 酶0.25 μ L，反应条件95°C预变性5min，94°C变性45s，50°C退火45s，72°C延伸lmin，重复35个循环，72°C保温lOmin。
[0024]实施例四:鞘氨醇杆菌Sphingobacterium griseoflavus SCU-B140的应用
硝酸盐还原:滴加格里斯氏试剂A，B到待测细菌培养液中，若变红色，则为硝酸盐还原阳性，若不变色，滴加二苯胺试剂后，仍不呈蓝色，则为硝酸盐还原阴性。结果显示测试菌株S⑶-Β140τ显红色，所以为硝酸盐还原阳性。
[0025]实施例五??Sphingobacteriumgriseoflavus SCU-B140对农药降解实验
将菌种接至TSB (深孔板，每孔6 mL)，37°C、140rpm培养，第二天同一时间加农药毒死蜱(12g/L，l% Tween 80助溶)200 μ L，取样检测毒死蜱含量，第三天同一时间取样，检测毒死蜱含量。毒死蜱含量检测方法:使用石油醚抽提，测抽提液293nm时的吸光度。实验重复三次，结果取平均值，结果为25.2%。
【主权项】
1.在一株农药降解菌Sphingobacterium griseoflavus SCU-B140，其保藏编号为KCTC42158ο2.如权利I所述的农药降解菌Sphingobacteriumgriseoflavus SQJ-B140，其特征为革兰氏阴性菌，好氧，细胞大小为0.4-0.6MmX 1.1-2.0Mm,菌落颜色为灰黄色，氧化酶和过氧化氢酶阳性，脲酶阴性，具有硝酸还原能力，细胞主要脂肪酸为iso-C15:。，summedfeature 3 (iso_C15:。2-OH and/or C16.j ω 7c)和 C16:。，主要呼吸醌为 MK-7，主要极性脂为磷脂酰乙醇胺(PE)，具有碱性磷酸酶、酯酶(C4)、脂肪酶(CS)、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶和N-乙酰-葡萄糖胺酶等酶活性，其G+C含量为41.22%，可利用碳源糊精、吐温40、吐温80、N-乙酰基-D-半乳糖苷、L-阿拉伯糖、D-纤维二糖、D-果糖、D-半乳糖、龙胆二糖、D-乳糖、乳果糖、麦芽糖、D-甘露糖、D-蜜二糖、β -甲基-D-葡萄糖苷、D-棉子糖、L-棉子糖、蔗糖、D-海藻糖、松二糖、乙酸、甘氨酰-L-谷氨酸、L-丝氨酸、L-苏氨酸。
【专利摘要】本发明公开了一种鞘氨醇杆菌<i>Sphingobacterium</i><i>？griseoflavus</i>？SCU-B140，其保藏编号为KCTC？42158。通过从蟋蟀体表分离、筛选、生理生化鉴定等工作，确定该菌株为杆状（图一），革兰氏阴性菌，好氧，菌落颜色为灰黄色。本发明的鞘氨醇杆菌氧化酶和过氧化氢酶阳性，脲酶阴性，具有硝酸还原能力，同时该菌株能降解农药毒死蜱，具有碱性磷酸酶、酯酶（C4）、脂肪酶（C8）、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶和N-乙酰-葡萄糖胺酶等酶活性，可广泛地应用在农药降解酶的开发和各类生物工程酶制剂的生产领域。附图是扫描电子显微镜50000倍下观察到的菌株SCU-B140的形貌。KCTC 4215820140626
【IPC分类】A62D101/04, C12N1/20, C12R1/01, A62D3/02, A62D101/28
【公开号】CN105238721
【申请号】CN201510715812
【发明人】田永强, 龙秀锋, 张帅
【申请人】四川大学
【公开日】2016年1月13日
【申请日】2015年10月30日