0.8，离心收集菌体，重悬于侵染培养液中，侵染前加入200 μ Μ乙酰丁香酮，得活化的农杆菌悬液。
[0029]2)农杆菌侵染外植体:
外植体选择山新杨(/b/wJiAs.davidianaXP.AoWeafla)无菌苗，取新鲜、幼嫩的无菌苗叶片，用解剖刀切成1cm2大小的叶盘，将叶盘与活化的EHA105 (pCAMBIA3301)菌液混合，室温下侵染15min。
[0030]3)农杆菌与外植体共培养:
在固体共培养基上放置灭菌滤纸，将农杆菌侵染后的外植体表面菌液吸净后放置在所述灭菌滤纸上，在22-23°C条件下黑暗培养3~4天。所述固体共培养基的制备方法为:蒸馏水加入0.7% (W/V)的琼脂粉，高压灭菌后加入200uM AS ο所述滤纸为Whatman N0.1定性滤纸(直径9cm)。
[0031]4)外植体诱导和筛选分化: 用附加250mg/L Timentin的无菌水洗外植体3_4遍，再用无菌滤纸吸去残留液体，于分化培养基上光照培养5-7天，然后转移至选择培养基(MS+ NAA0.1 mg/L +6-BA0.2 mg/L+TDZ0.01 mg/L +Km50mg/L+Timentin 250mg/L)上培养，待抗性芽长至l_2cm时转至生根培养基(MS+NAA0.1mg/L+Km50mg/L+Timentin 250mg/L)上生根。温度 25°C，光照 14h/d，光照强度 1600~20001uxo
[0032]实验结果:
侵染后的杨树叶片直接在培养基上共培养或在滤纸上共培养3天。共培养结束后挑取叶片进行GUS瞬时表达检测。结果显示，使用干燥共培养时GUS瞬时表达率和GUS瞬时平均表达量，均比直接在普通培养基上共培养时高10%左右。
[0033]实施例3
一种农杆菌介导外植体遗传转化方法，包括:
1)农杆菌的活化:
根癌农杆菌菌株为LBA4404，携带双元载体质粒pBI121。该质粒T-DNA区带有β-葡萄糖苷酸酶(⑶S)基因和新霉素磷酸转移酶(ΝΡΤ II )基因，均由CaMV35S启动子驱动。从-80°C冰箱中取出农杆菌，在冰上融化后接种于5ml YEP (添加50mg/L利福平(Rif)、50mg/L卡那霉素(Km))液体培养基中，28°C，200rpm过夜振荡培养；次日扩大培养于50ml的YEP液体培养基中，振荡培养至0D_=0.6-0.8，离心收集菌体，重悬于侵染培养液中，侵染前加入200 μ Μ乙酰丁香酮，得活化的农杆菌悬液。
[0034]2)农杆菌侵染外植体:
外植体选择普通小麦(7—riiic? aestivum L.)品种EM12的幼胚或成熟胚。将外植体与活化的农杆菌悬液混合，常温下侵染30min。
[0035]3)农杆菌与外植体共培养:
共培养方式:一种为直接在普通共培养培养基(MS (大量、微量、有机、肌醇)+3% (W/V)蔗糖+0.7% (W/V)琼脂粉+200 μ M AS)上进行共培养；另一种在简化固体共培养基上放置灭菌滤纸，将农杆菌侵染后的外植体表面菌液吸净后放置在所述灭菌滤纸上，在22-23°C条件下黑暗培养3~4天。所述固体共培养基的制备方法为:蒸馏水加入0.7% (W/V)的琼脂粉，高压灭菌后加入200uM AS ο所述滤纸为Whatman N0.1定性滤纸(直径9cm)。
[0036]4)外植体诱导和筛选分化:
用附加250mg/L Timentin的无菌水洗外植体3_4遍，再用无菌滤纸吸去残留液体，于诱导培养基上黑暗培养3-4周，然后转移至选择培养基(MS+2，4-D0.1mg/L+Zeatin5.0mg/L+G418 25mg/L+Timentin 250mg/L)上培养，待抗性芽长至l_2cm时转至生根培养基(MS+NAA0.lmg/L+G418 25mg/L+Timentin 250mg/L)上生根。温度 25°C，光照 16h/d，光照强度 1600~20001ux。
[0037]实验结果:
侵染后的小麦幼胚或成熟胚直接在培养基上共培养或在滤纸上共培养3天。共培养结束后3天挑取愈伤组织进行⑶S瞬时表达检测。结果显示，使干燥共培养时⑶S瞬时表达率和⑶S瞬时平均表达量，均比直接在普通培养基上共培养时高15%左右。使用简化培养基干燥共培养时GUS瞬时表达率达到90%以上，GUS瞬时表达位点遍布整个愈伤组织。
[0038]另外，在滤纸上共培养后的愈伤组织含菌量较少。使用滤纸上共培养处理时，洗菌后涂平板，发现农杆菌菌斑数较少，浓度较低，能有效减少外植体携带菌量，因此使转化受体在诱导、筛选分化阶段易于控制农杆菌的繁殖。可见，在滤纸上共培养处理比直接在培养基上共培养更有助于提高根癌农杆菌转化效率(图1)。
【主权项】
1.一种农杆菌介导外植体遗传转化方法，包括:1)农杆菌的活化、2)农杆菌侵染外植体、3)农杆菌与外植体共培养、4)外植体诱导和筛选分化，其特征在于:所述农杆菌与外植体共培养步骤的操作为:在固体共培养基上放置灭菌滤纸将农杆菌侵染后的外植体表面菌液吸净后放置在所述灭菌滤纸上黑暗培养3~4天，培养温度22~23°C。2.根据权利要求1所述的农杆菌介导外植体遗传转化方法，其特征在于:所述固体共培养基的制备方法为:蒸馏水加入0.7%的琼脂粉，高压灭菌后加入200uM乙酰丁香酮。3.根据权利要求1所述的农杆菌介导外植体遗传转化方法，其特征在于:所述滤纸为Whatman N0.1定性滤纸。4.根据权利要求1所述的农杆菌介导外植体遗传转化方法，其特征在于:所述农杆菌活化的具体操作为:取冻存农杆菌，在冰上融化后接种于5ml YEP液体培养基中，28 °C，200rpm过夜振荡培养；次日扩大培养于50ml的YEP液体培养基中，振荡培养至OD600=0.6-0.8，离心收集菌体，重悬于侵染培养液中，侵染前加入200 μ Μ乙酰丁香酮，得活化的农杆菌悬液。5.根据权利要求1所述的农杆菌介导外植体遗传转化方法，其特征在于:所述农杆菌侵染外植体的具体操作为:外植体与活化的农杆菌悬液混合，浸染时间为10~30min。6.根据权利要求1所述的农杆菌介导外植体遗传转化方法，其特征在于:所述外植体诱导和筛选分化过程的具体操作为:经过共培养后的外植体用附加200~300mg/L Timentin的无菌水清洗后，以无菌滤纸吸去残留液体，于分化培养基上光照培养5-7天，转移至选择培养基上培养，待抗性芽长至l_2cm时转至生根培养基上生根，分化培养、选择培养、生根培养的条件:温度25°C，光照14h/d，光照强度1600~20001ux。7.根据权利要求1所述的农杆菌介导外植体遗传转化方法，其特征在于:所述外植体诱导和筛选分化过程的具体操作为:经过共培养后的外植体用附加250mg/L Timentin的无菌水洗3-4遍，再用无菌滤纸吸去残留液体，于诱导培养基上黑暗培养3-4周，然后转移至选择培养基上培养，待抗性芽长至l_2cm时转至生根培养基上生根，所述诱导培养、选择培养、生根培养的条件:温度25°C，光照16h/d，光照强度1600~20001ux。8.根据权利要求1所述的农杆菌介导外植体遗传转化方法，其特征在于:所述外植体为叶片、叶柄、茎、幼胚、成熟胚。9.根据权利要求1所述的农杆菌介导外植体遗传转化方法，其特征在于:所述农杆菌菌株为 EHA105、LBA4404、GV3101、AGL1。
【专利摘要】本发明为一种农杆菌介导外植体遗传转化方法，包括：农杆菌的活化、农杆菌侵染外植体、农杆菌与外植体共培养、外植体的诱导和筛选分化，其中共培养步骤的操作为：在固体共培养基上放置灭菌滤纸，将农杆菌侵染后的外植体表面菌液吸净后放置在所述灭菌滤纸上培养3~4天。固体共培养基的制备方法为：蒸馏水加入0.7%（W/V）的琼脂粉，高压灭菌后加入200uM乙酰丁香酮。本发明使遗传转化过程中农杆菌与外植体共培养时农杆菌能够充分接触外植体而不过度生长，提高转化效率，且简化培养基能够减少污染几率。
【IPC分类】C12N15/84, A01H5/00
【公开号】CN105238813
【申请号】CN201510805221
【发明人】丁莉萍, 魏建华, 王宏芝, 陈亚娟, 张杰伟, 李瑞芬
【申请人】北京农业生物技术研究中心
【公开日】2016年1月13日
【申请日】2015年11月20日