一种桑叶有效成分的统筹提取方法
【技术领域】
[0001]本发明属桑叶提取技术领域，涉及一种桑叶有效成分的统筹提取方法，是一种分步高效提取桑叶中多种有效成分的方法，也即是通过高浓度醇提，将桑叶以目标产物为对象拆解开来，再实施后一步针对性提取工艺，而制得桑叶多糖、桑叶黄酮、桑叶叶绿素、桑叶膳食纤维和桑叶I脱氧野尻霉素多种产品的方法。
【背景技术】
[0002]桑叶为桑科植物桑(Morus alba L.)的干燥叶，是传统桑蚕的主饲料，果桑的副产品，在我国大部分地区均有生产，一年四季均可采集；其来源广泛易得、资源丰富、价格便宜。其味苦、甘，性寒，据《本草纲目》记载:“桑箕星之精神也，蝉食之称文章，人食之老翁为小童。”素有“人参补热，桑叶清补”之美誉，不仅富含人体17种氨基酸，粗蛋白、粗脂肪，同时因其含有占桑叶干重2% -3%的桑叶黄酮、0.5%桑叶γ-氨基丁酸、0.15%桑叶1-脱氧野尻霉素(1-deoxynojirimycin，简称DNJ)、2% -4%的桑叶多糖、4% -8%的桑叶蛋白，记忆20% -30%的桑叶粗纤维等具有药用保健作用成分，是国家卫生部确认的“药食同源”植物。
[0003]目前国内外对从桑叶中提取并制备单一或有种混合成分的产品做了一些研究:
[0004]中国专利:CN03101988.9公开了一种桑叶总碱浸膏的制剂及其制备方法，其主要步骤为:干桑叶粉碎，用水或亲水溶剂提取，浓缩，调节PH =3-5，加絮凝剂，静置，上清液离子交换，洗至无色，倒出树脂加碱浸泡，再用亲水溶剂回流树脂，收集馏出液浓缩制浸膏。该方法不足之处在于，只利用了亲水溶剂提取的桑叶部分有效成分，未考虑桑叶中醇溶性物质及不容物的利用，造成原料的严重浪费。同时将桑叶亲水性提取物混合在一起，经离子交换后，回流提取离子树脂，对树脂的耗费巨大，不利于生产，经回流所得混合组分成分复杂，只是初级产品，附加值低，不利于产品获利。
[0005]中国专利:CN200810122998.7公开了一种从桑叶总生物碱中分离1_脱氧野尻霉素单体的方法，其主要步骤为:将桑叶生物碱提取物溶于水，离子交换树脂处理后，湿法装柱，吸附后洗脱，分布收集洗脱液，并对洗脱液定性检测，与1-脱氧野尻霉素对照品进行比较，合并单一相同组分洗脱液，减压浓缩，真空干燥，多次重结晶，得1-脱氧野尻霉素单体。该方法不足之处在于，只利用了桑叶生物碱中极少部分成分(占桑叶含量0.1% -0.3%),造成原料的严重浪费。
[0006]中国专利:CN200810236144.1公开了一种联产桑叶黄酮、多糖和生物碱的复合提取工艺，其主要步骤为:原料处理、水提取、大孔树脂吸附分离，其中采用氯仿作为萃取剂，有毒，在产品生产过程中很难除去，不适宜工业化生产。
[0007]中国专利:CN200710027588.X公开了一种桑叶提取物及其制备方法与应用工艺，其主要步骤为:桑叶通过超声波处理、经水提与薄膜浓缩得到，含有多糖类(纯度12%以下)、黄酮及黄酮苷(纯度5 %以下)、生物碱(纯度0.8 %以上)、留醇类、维生素类、氨基酸类等多种功能物质。该方法不足之处在于，获得的多种成分提取物含量过低，且未经分离商业收益少。
[0008]中国专利:CN201010216512.3公开了一种桑叶黄酮、生物碱复合物的提取分离方法，其主要步骤为:用酸化的去离子水对桑叶浸提；乙酸乙酯萃取；桑叶黄酮采用大孔树脂DlOl吸附分离，洗脱液为70?90%乙醇溶液；桑叶生物碱用阳离子交换树脂进行分离。该方法不足之处在于，用酸化去离子水提取，获得的有效成分不高，最终产品种类少，未能将桑叶资源充分利用，所获的单一产品纯度较低。
[0009]中国专利:CN201210190238.6公开了一种利用滤膜和树脂制备桑叶1_脱氧野尻霉素提取物的方法，其主要步骤为:将桑叶水提物浸膏用水溶解后，依次进行微滤、超滤处理，透过液进行大孔吸附树脂、强酸性阳离子交换树脂柱和强碱性阴离子交换树脂柱处理，获得所述桑叶1-脱氧野尻霉素提取物。该方法不足之处在于，使用微滤、超滤技术获得提取物，速度慢，成本高，不利于工业化生产。
【发明内容】
[0010]本发明的目的是提供一种桑叶有效成分的统筹提取方法，是一种通过简洁统筹的工艺，获得多种桑叶产品(色素、多糖、黄酮、1-脱氧野尻霉素、桑叶粗蛋白、桑叶膳食纤维)的方法；解决了桑资源在制取成提取物的过程中存在的大量浪费，充分高效的利用了桑叶的所有部分，获得多种产品，各产品经精制还可制得高纯度的单类物质，灵活可调，对桑叶综合利用生产提升了附加值，具有良好的商业前景，适合大规模工业化生产。
[0011]本发明的一种桑叶有效成分的统筹提取方法，包括以下步骤:
[0012](I)将桑叶粉与乙醇-水溶液混合均匀，并在30-50°C条件下超声萃取后，离心分离得滤渣Cl和醇提滤液Al ;在加热条件下，将桑叶干粉通过高速剪切搅拌均匀地分散在乙醇溶剂中，通过超声的机械和空化效应使桑叶细胞中的有效成分透过细胞快速的溶解在溶剂中缩短反应时间，提高提取效率；其使用的乙醇-水溶液浓度为70-90v/v%。
[0013](2)将所述滤渣Cl与乙醇-水溶液混合均匀，在30-50°C条件下超声萃取后离心分离得滤渣C2和滤液A2 ;经一次萃取，原乙醇溶剂中所溶出的有效成分含量较高，需更换新的萃取液，重新形成低浓度环境，拉动桑叶细胞内残留的有效成分再次分散溶解在乙醇萃取液中，从而获得较高的提取得率。其使用的乙醇-水溶液的浓度为60-80v/v%。
[0014](3)合并醇提滤液Al和滤液A2，得滤液A3 ;将两次醇提液混合均匀，使桑叶中的有效成分在乙醇液中的含量适中便于后续工艺统一处理。
[0015](4)将滤渣C2减压蒸发脱去乙醇，至无醇味后，与水混合均匀，在40_60°C条件下超声萃取，离心分离得滤渣C3和滤液BI ;为避免醇提后滤渣吸附的乙醇抑制下步工艺提取要获得的多糖及蛋白在去离子水中的溶解，同时带入其他醇溶性成分污染水提液，需脱去滤渣中的乙醇再进行水提；在加热条件下，将桑叶干粉通过高速剪切搅拌均匀地分散在去离子水中，通过超声的机械和空化效应使桑叶细胞中的多糖等成分透过细胞快速的溶解在溶剂中缩短反应时间，提高提取效率。其使用的水为去离子水。
[0016](5)再将滤渣C3与水混合均匀，在40-60°C条件下超声萃取，离心分离得滤渣C4和滤液B2 ;经一次萃取，原去离子水中所溶出的目标成分含量较高，需更换新的萃取液，重新形成低浓度环境，拉动桑叶细胞内残留的目标成分再次分散溶解在萃取液中，从而获得较高的提取得率。其使用的水为去离子水。
[0017](6)合并滤液BI和滤液B2，并浓缩至原体积的1/10-1/20，得浓缩液B3 ;将两次水提液合并，浓缩至小体积便于后续工艺处理。
[0018](7)滤渣C4依次用碱液和酸液在加热和高速搅拌及超声条件下处理，离心过滤；滤出的酸洗后滤渣经漂白和去残余脂溶性物后制备得到高溶胀性膳食纤维；所述高溶胀性膳食纤维的溶胀性多9.0ml/g，持水率多250% ;在加热条件下，桑叶残渣通过高速剪切搅拌均匀地分散在热的碱液和酸液中，碱液使纤维骨架膨胀、疏散，并在超声的穿透作用下使OH-与纤维上的蛋白、多糖、脂肪、鞣质等接触反应，加速杂质组分脱除；酸液使纤维收缩，将经碱洗未脱除的小分子糖类及色素、无机盐暴露于纤维表面，在超声的机械作用下，从纤维中脱除；漂白使纤维中的色素类物质氧化，改善产品外观；再利用乙醇的脂溶性将酸碱洗及漂白氧化过程中新产生的小分子物质及色素溶解并通过离心作用脱除，制得高溶胀性膳食纤维。其使用的碱可为NaOH、KOH等中的一种或其混合的试剂；使用的酸可为盐酸、醋酸、柠檬酸等中的一种或其混合的试剂；使用的漂白剂为过氧化氢、次氯酸钠等中的一种或几种。
[0019](8)在所述浓缩液B3中加入乙醇，于2-4°C下沉淀6_8小时，过滤得滤渣C5，滤液回收乙醇；溶解在浓缩液中的多糖及蛋白在乙醇溶液中溶解度降低，在2-4°C低温静置过程中析出，除去浓缩液中其它小分子杂质，获得目标物质。其使用的乙醇浓度80-100v/v%。
[0020](9)所述滤渣C5用去离子水重新溶解，并依次加入ZTC1+1澄清剂A和B组分，在45-50°C下，每隔20分钟搅拌一次，保温5-6小时，过滤得粗多糖滤液Tl和蛋白滤渣Dl ;将所得滤渣重新溶解在去离子水，配制成适合浓度的工艺液体，通过澄清剂的絮凝作用将其中含有蛋白成分从多糖中分离。其使用的澄清剂为ZTC1+1。
[0021 ] (10)粗多糖滤液Tl经喷雾干燥，即得桑叶粗多糖；将得到的粗多糖滤液喷雾干燥制成粉剂便于包装和储存。
[0022](11)将蛋白滤渣Dl加去离子水配置成悬浮液，加入Alcalase蛋白酶，调节pH =7-7.5，在45-50°C水解4_5小时；将水解液灭除酶活性冷却至室温后再加入Papain蛋白酶，调节pH = 6-6.5，在30-35°C水解2_3h，过滤得蛋白水解液D2 ;将蛋白水解液D2灭除酶活性后冷却至室温过大孔树脂，流出的过柱液冷冻干燥，得桑叶低聚肽；将得到的蛋白滤渣通过两种蛋白酶分别对蛋白的侧链及肽键剪切，使大分子蛋白断裂分解，从而得到小分子的低聚肽，再通过高温作用灭除蛋白酶活性终止反应，防止过度水解，即可获得桑叶低聚肽。为防止高温干燥使低聚肽中有效成分分解，采取低温冷冻干燥，干燥后便于包装和储存。其使用的蛋白酶为Alcalase蛋白酶和Papain蛋白酶。
[0023](12)将所述滤液A3在温度50-70°C真空度0.06-0.08MPa下减压浓缩到原体积的1/10-1/20，形成色素糊浆的水状液，经低速离心分离，得到色素糊浆和离心分离掉的下层液体；取离心分离掉的下层液体与石油醚按I?2:1的体积比混合，萃取2-4次，至石油醚层基本无颜色即完成脱色过程，得下层萃余液A4和萃取的上层色素液；在萃取的色素液中加入0.2-0.5w/w%碳酸钠溶液，经旋转蒸发回收石油醚后，与所述色素糊浆合并为混合色素糊浆SI ;将桑叶醇提液浓缩，溶液极性减小，使溶于其中的色素析出悬浮在溶液中，再通过低速离心分离得到上层色素糊浆；离心分离掉的下层液体中仍含有部分色素未析出，再经石油醚萃取，使醇提液完全脱色，为下步工艺做准备；得到的色素中加入碳酸钠溶液旋转蒸发，防止蒸发时酸浓度过高对叶绿素造成破坏，同时回收溶剂。
[0024](13)所述混合色素糊浆SI制成桑叶叶绿素铜钠盐产品的具体步骤如下:
[0025](a)将所述混合色素糊浆SI置于乙醇水溶液、丙酮、氢氧化钠水溶液和石油醚的混合溶剂中，调节水层pH值至11?12，在温度45?50 °C下，搅拌阜化反应30?45min ；皂化反应是可逆的，石油醚与乙醇、丙酮部分混溶形成有机层，NaOH水溶液与部分乙醇、丙酮混合形成碱水层。反应开始时碱水层中无原料部分，原料存在于有机层中，通过乙醇起到物质传递作用，将NaOH带入有机层与原料皂化，同时将得到皂化产物水溶性叶绿素及时带出，立刻溶解在碱水层中，移走反应产物使平衡向生成产物方向偏移，加快反应速度。反应结束后有机层转为吸附不皂化脂溶性部分及反应产生的有机碎片，使之与水溶性叶绿素分离，达到便于产物分离的目的。其使用的混合溶剂中，乙醇水溶液、丙酮、氢氧化钠水溶液和石油醚的体积比为5?10:8?10:5?7:15?20 ;所述混合色素糊浆SI与乙醇水溶液的质量体积比为1:10?15 ;
[0026](b)分离除去上层的石油醚层液，留用下层的碱水层液；将含有水溶性叶绿素的碱水层与有机层分离，便于下步工艺进行。
[0027](c)将所述碱水层液浓缩至原体积的1/2?1/3，冷却至室温，即得含水溶性叶绿素的混合液；将反应后碱水层还溶的丙酮、乙醇、叶留醇等其他反应产物及溶剂，通过加热浓缩蒸发带走，保留水溶性叶绿素，缩小总体积易于后续工艺处理。
[0028](d)将所述含水溶性叶绿素的混合液加入稀盐酸调节pH值至5?7，加入饱和硫酸铜溶液，加热铜代，过滤后得铜代母液；将PH值至5?7使Cu2+离子在偏酸性的条件下取代叶绿素吡咯环中的H+及Mg2+离子生成叶绿素铜酸，避免浓缩后在强碱性水溶性中直接加入硫酸铜生成氢氧化铜沉淀，使反应不完全；其中所使用的盐酸为:3?5wt%浓度的盐酸水溶液；其饱和硫酸铜溶液与水溶性叶绿素溶液的体积比为2-5:1。
[0029](e)所述铜代母液加入稀盐酸调节pH值至2.0?2.2，静置结晶后过滤得滤渣；生成的叶绿素铜酸在pH = 2.0?2.2，在溶液中溶解度最小，从而易于从溶液中析出，达到分离叶绿素铜酸的目的；其使用的盐酸为:3?5wt%浓度的盐酸水溶液。
[0030](f)将所述滤渣分别通过如下三次次洗涤过程:
[0031]①用50?60°C去离子水淋洗I?2次，滗去水液；
[0032]②用30?40v/v%的乙醇水溶液淋洗I?2次，至乙醇层刚出现绿色，