应用表达gfp或其突变体的转基因巨噬细胞观察溶酶体形态和功能的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种应用表达GFP或其突变体转基因巨噬细 胞观察溶酶体形态和功能的方法。
【背景技术】
[0002] 溶酶体（lysosome)是由单层膜所包围的囊泡状细胞器，内含多种高浓度酸性水 解酶，是细胞进行内消化作用的主要场所。典型的细胞中含有大约数百个溶酶体，直径介于 数百纳米至数个微米之间，在不同的细胞类型中，其数量和形态有很大差异，即使在同一种 细胞中，其大小、形态也不尽相同。溶酶体作为细胞内消化器官，参与细胞自溶、防御等生物 过程。
[0003] 现有技术中观察细胞溶酶体超微结构通常使用透射电子显微镜或荧光显微镜。 应用透射电子显微镜方法对组织处理有特殊要求，不能观察活细胞的溶酶体，并且电镜 样品制备既费时，成本又高。中性红（Neutral Red)和卩丫啶橙（Acridine Orange)可用 于对溶酶体进行焚光染色，但中性红和吖啶橙的染色缺乏特异性。Lyso-Tracker系列和 Lyso-Sensor系列的多种溶酶体荧光探针，带有弱碱性，可以选择性地滞留在偏酸性的溶酶 体中，使溶酶体在荧光显微镜下呈现特定颜色的荧光，根据具体的检测需求，可分别用于活 细胞溶酶体特异性荧光标记定位，或用于检测溶酶体的酸性程度，或用于溶酶体动力学研 究等。但是弱碱性的Lyso-Tracker系列或Lyso-Sensor系列的多种溶酶体焚光探针进入 溶酶体后，不可避免会在不同程度上影响溶酶体内的酸性微环境，进而影响其内消化功能， 不利于进行溶酶体功能的活体研究。此外，溶酶体摄入这些荧光探针的过程是动态的，在特 定的检测时间点，可能出现部分溶酶体标记遗漏，导致实验误差。目前，尚无有效方法解决 上述问题。
【发明内容】
[0004] 本发明要解决的技术问题是针对现有技术存在的缺陷，提供一种能够观察活细胞 内溶酶体的超微结构而又不影响其内消化功能的方法。
[0005] 为解决上述技术问题，本发明的第一方面提供一种应用表达GFP或其突变体的转 基因巨噬细胞观察溶酶体形态和功能的方法，包括以下步骤：
[0006] (1)分离、培养表达GFP或其突变体的转基因巨噬细胞；
[0007] (2)将前述分离培养的巨噬细胞悬液，置于激光扫描共聚焦显微镜（laser scanning confocal microscope，LSCM)下进行观察。
[0008] 本发明优选的技术方案中，表达GFP或其突变体转基因巨噬细胞，选自GFP转基因 巨噬细胞、EGFP转基因巨噬细胞、YFP转基因巨噬细胞、EYFP转基因巨噬细胞、CFP转基因 巨噬细胞任意一种或两种以上。
[0009] 本发明优选的技术方案中，表达GFP或其突变体的转基因巨噬细胞包括表达GFP 或其突变体的转基因动物来源的转基因巨噬细胞。
[0010] 本发明优选的技术方案中，表达GFP或其突变体的转基因动物包括表达GFP或其 突变体的转基因小鼠，表达GFP或其突变体的转基因大鼠。
[0011] 本发明优选的技术方案中，表达GFP或其突变体的转基因巨噬细胞还包括：通过 获取来源于人源、小鼠源、或大鼠源的野生型原代巨噬细胞，利用基因工程技术，使其瞬时 表达或稳定表达表达GFP或其突变体，从而制备成表达GFP或其突变体的转基因巨噬细胞。
[0012] 本发明优选的技术方案中，GFP转基因巨噬细胞还包括：利用基因工程技术制备 的瞬时表达或稳定表达GFP的人源、小鼠源、或大鼠源的巨噬细胞起源的肿瘤细胞或肿瘤 细胞系。
[0013] 本发明优选的技术方案中，表达GFP或其突变体的转基因巨噬细胞包括利用基因 工程技术制备的瞬时表达或稳定表达GFP的小鼠巨噬细胞RAW264. 7细胞。
[0014] 本发明优选的技术方案中，所述步骤（2)中，将所述的巨噬细胞悬液用LSCM专用 玻底培养皿培养，再置于LSCM下观察。
[0015] 本发明的第二方面，提供一种表达GFP或其突变体的转基因巨噬细胞悬液通过 LSCM用于溶酶体形态和功能的观察。
[0016] 本发明优选的第二方面技术方案中，表达GFP或其突变体转基因巨噬细胞，选自 GFP转基因巨噬细胞、EGFP转基因巨噬细胞、YFP转基因巨噬细胞、EYFP转基因巨噬细胞、 CFP转基因巨噬细胞任意一种或两种以上。
[0017] 本发明优选的第二方面技术方案中，表达GFP或其突变体的转基因巨噬细胞包括 表达GFP或其突变体的转基因动物来源的转基因巨噬细胞。
[0018] 本发明优选的第二方面技术方案中，表达GFP或其突变体的转基因动物包括表达 GFP或其突变体的转基因小鼠，表达GFP或其突变体的转基因大鼠。
[0019] 本发明优选的第二方面技术方案中，表达GFP或其突变体的转基因巨噬细胞还包 括：通过获取来源于人源、小鼠源、或大鼠源的野生型原代巨噬细胞，利用基因工程技术，使 其瞬时表达或稳定表达表达GFP或其突变体，从而制备成表达GFP或其突变体的转基因巨 噬细胞。
[0020] 本发明优选的第二方面技术方案中，GFP转基因巨噬细胞还包括：利用基因工程 技术制备的瞬时表达或稳定表达GFP的人源、小鼠源、或大鼠源的巨噬细胞起源的肿瘤细 胞或肿瘤细胞系。
[0021] 本发明优选的第二方面技术方案中，表达GFP或其突变体的转基因巨噬细胞包括 利用基因工程技术制备的瞬时表达或稳定表达GFP的小鼠巨噬细胞RAW264. 7细胞。
[0022] 绿色荧光蛋白（GFP)以及GFP突变体作为一种新型荧光报告分子或定位标记物日 益受到重视，在基因标记、基因表达控制、转基因的动植物研究、蛋白在细胞中功能的定位 及蛋白间相互作用等方面有十分广泛的用途。GFP可在各种异源细胞中表达，且对寄主细胞 不存在毒性。GFP在哺乳动物细胞内的长期表达对细胞的生长发育不会产生有害影响，GFP 转基因小鼠已经成为生命科学研究中重要的模型动物。
[0023] GFP突变体包括：EGFP、YFP、EYFP、CFP;YFP是黄色荧光蛋白，其序列与GFP基本相 同。YFP就是把Thr203以Tyr取代，这样不发出绿色荧光，而发出较长波长的黄色荧光。而 EGFP是增强型的GFP，发生了双氨基酸取代，Leu亮氨酸取代GFP上的Phe64, Thr取代GFP 上的Ser65。CFP类似，酪氨酸Tyr66被色氨酸Thr取代，则发出蓝色荧光。
[0024] GFP荧光性质稳定，在pH值5. 5~12的范围内都可以保持较高的荧光性能，GFP 荧光可在pH值7~12的试剂中保持稳定，pH值5. 5~7. 0时，荧光强度减弱。但极端的 pH，如pH值〈5. 0或pH值>12. 0时，GFP的荧光消失。
[0025] 细胞中的溶酶体（Lysosome)是具有单层膜结构的酸性细胞器，其内部pH值比胞 液的pH值低大约2个单位，通常为PH值5. 0,该酸性环境有利于维持其内部的酸性水解酶 活性。GFP转基因小鼠来源的巨噬细胞表达有GFP，在细胞内分布广泛均匀，理论上，GFP荧 光信号能够遍布整个转染GFP基因的巨噬细胞，但是溶酶体内的酸性环境可以导致GFP荧 光信号的猝灭。在LSCM下表现为整体呈绿色荧光的细胞质中存在较多的圆点状绿色荧光 负染区。虽然GFP进入溶酶体荧光淬灭，但蛋白结构稳定不易被降解，GFP连同自噬体内膜 和内容物一起被溶酶体降解，在自噬性溶酶体降解后会释放出游离的GFP。
[0026] 本发明中，GFP转基因动物，不仅包括小鼠，大鼠，当然还包括商业渠道可以购买到 的其它种类的GFP转基因动物。
[0027] 激光扫描共聚焦显微镜（laser scanning confocal microscope，LSCM)用激光做 光源并采用了共聚焦技术消除了透镜的色差和球差，运用点扫描技术，使标本上每一点的 图像避免了相邻点的衍射光和散射光的干扰，得到的共聚焦图像克服了普通显微镜图像模 糊的弱点，且结果用计算机处理，因而其图像高度清晰且数字化。它通过微量步进马达，控 制载物台升降，使焦平面沿标本Z轴方向依次位于不同层面上，可以逐层获得标本相应光 学横断面的XY平面图像，即"光学切片"，进而可以进行三维图像重建。另外配置显微活细 胞培养系统的激光扫描共聚焦显微镜还可以动态地观察活细胞的荧光变化。
[0028] 本发明应用表达GFP或其突变体的转基因巨噬细胞观察溶酶体，无需染色，即可 清晰显示溶酶体的位置；通过LSCM可以清晰、直观地观察到表达GFP或其突变体的转基因 巨噬细胞内溶酶体的超微结构形态、数量以及动态变化。如果将底物以红色荧光探针进行 标记，还可以直观的显示出尚未开始进行消化作用的初级溶酶体和内含相应底物、正在进 行或完成消化作用的次级溶酶体的数量，并可以展示出次级溶酶体内底物消化的位置。
[0029] 与透射电子显微镜比较，LSCM不仅在样品制备中耗时少且费用低，更有利于反映 溶酶体在表达GFP或其突变体的转基因巨噬细胞内的空间结构关系，为溶酶体的功能研究 提供了 一种便于活体实时观察的新方法。
【附图说明】
[0030] 下面结合附图及实施例对本发明作进一步描述：
[0031] 图1为GFP在表达GFP的转基因巨噬细胞（简称Μφ-GFP )中的分布特点，在LSCM 下表现为整体呈绿色荧光的细胞质中存在较多的圆点状绿色荧光负染区（红色箭头示）。 其中，la为明视野下的Μφ-GFP观察结果，lb SMcp-GFP的绿色荧光图，lc为la和U的融 合图，Id为加入红色箭头标识的lb局部放大图。
[0032] 图2为溶酶体焚光探针Lyso-Tracker Red染色显不Lyso-Tracker Red的红色焚 光位于Μφ-GFP的绿色荧光负染区内。其中，2a和2d为Μφ-GFP的绿色荧光图；2b和2e为 Μφ-GEP经过溶酶体荧光探针Lyso-Tracker Red染色后的红色荧光图，2c为2a和2b的融 合图；2f为2d和2e的融合图。
[0033] 图3为内质网红色荧光探针ER-Tracker Red和细胞核蓝色荧光探针DAPI染色显 示Μφ-GFP的荧光负染区所代表的不是内质网或细胞核。其中，3a为Μφ-GEP的绿色荧光 图；3b为内质网红色荧光探针ER-Tracker Red染色后的红色荧光图；3c为细胞核蓝色荧光 探针DAPI染色后的蓝色荧光图；3d为3a、3b和3c的融合图。
[0034] 图4为Μφ-GFP对Exo-Dil的摄取。其中，4a为Μφ-GFP的绿色焚光图，4b为标示 细胞内Exo-Dil的红色荧光图，4c为4a和4b的融合图。
[0035] 图5为Μφ-(」Γ-'Ρ中的大溶酶体。其中，5a和5d为Μφ-GFP的绿色焚光图，5b和5e 为细胞内E