用于dna和rna检测的双探针：反探针组合物的制作方法

用于dna和rna检测的双探针：反探针组合物的制作方法
【专利说明】用于DNA和RNA检测的双探针:反探针组合物
[0001]相关申请的交叉引用
[0002]本国际申请根据37 C.F.R.§ 1.119(e)要求2013年3月26日提交的美国临时申请序列号61/805，272的优先权权益，该临时申请现已放弃，该临时申请的全部内容通过引用并入本文。
[0003]发明背景
[0004]应用范围
[0005]本公开涉及核酸探针技术领域，特指用于鉴定和定量分析目标DNA或RNA序列的复合物及方法。尤其是在扩增过程中或扩增后，用以标记及检测有科学意义及临床意义的正常或突变靶序列。
[0006]相关技术的描述
[0007]通常运用杂交的方法，将标记的DNA探针与感兴趣的靶基因结合来检测目的基因的核酸序列。为了获得好的检测结果，在杂交后必须对杂交产物进行清洗以去除未结合及非特异性结合的探针。然而，在实时定量PCR的过程中(美国专利4965188 ;美国专利5210015 ;美国专利5487972 ;美国专利5538848)，无法进行洗涤。因此，必须设计出新的探针，这种探针与目的基因结合的时候，能选择性的发出信号。而当他们未结合或者游离在溶液中时，信号减弱或者淬灭。曾经使用过一种探针来达到这一目的。该探针能够在供体分子和受体分子之间，诸如两个焚光之间或焚光剂和淬灭剂之间，激发并转移焚光能量。(Didenko V，2001，B1techniques 31:1106-1116,1118,1120-1121 ；Chen et al.,1997,Proc.Natl.Acad.Sc1.USA 30:94:10756-10762)。供体的荧光发射谱与受体的吸收或激发谱重叠，当受体和供体距离比较近时(10-100angstroms)，供体的激发态能量就转到受体分子上，这时，如果受体分子为荧光剂，就能激发长波长的信号。但如果受体分子为淬灭剂，荧光信号会显著减少甚至消失。
[0008]TAQMAN.RTM和分子信标探针常用于实时定量PCR检测。这两种探针都能作为内部探针，与一对引物结合，而这对引物又分别与目的基因序列侧翼结合。引物扩增靶基因片段，而探针选择性结合到一个标识序列之间，从而导致荧光信号增加。尽管这些探针的作用相似，但它们的检测机制不同。
[0009]TAQMAN.RTM探针由短的寡核苷酸构成，该寡核苷酸与靶序列互补。探针尾部标记荧光供体和受体(美国专利5538848)。通常荧光团例如荧光素与更长波长的荧光团(例如TAMRA的。R商标)或非荧光淬灭剂，如BLACK HOLE QUENCHER.RTM,配对。虽然TAQMAN:RTM专利已经过期，但仍然为实时PCR探针的主要技术。
[0010]分子信标探针也是利用荧光相互作用来检测PCR产物(美国专利5925517 ;Tyagiet al., 1996, Nat.B1technology 14:303-308)，但是，该探针的末端包含短互补序列，这些序列相互结合形成颈环结构。在此猝灭剂和荧光标记的末端距离很近，从而抑制荧光的产生。
[0011]SCORP1N.RTM探针的检测机制也是发夹机制，不同的是该探针还具有spacer ?并连接一段引物(Whitcombe et al，1999 年，Nat.B1technol.17:804-80 7;美国专利6，326，145)。在未杂交时该探针保持荧光淬灭的发夹结构，但发生变性，退火，并与模板结合后，发夹结构打开，荧光信号得以释放。
[0012]类似于SCORP1N.RTM, SUNRISE.RTM探针包含一段引物，该引物连接于发夹探针上，该探针扩增时延伸。这样就将淬灭剂同5’端的焚光剂分开(Nazarenko et al., 1997,Nucl.Acids Res.25:2516-2521)。
[0013]其它实时PCR探针包括:(a)双杂交探针(Wittwer et al.，1997，B1Techniques22:130-138)。该探针涉及两个和模板互补且相连的荧光探针。其原理是两个相邻标记物之间荧光能量的转移；以及(b) LUX引物探针(Kusser，2006，Methods Mol.B1l.335:115-133) o该引物对中的一个引物:V端用荧光团标记。该引物自身折叠并与引物5’端的短序列互补，使荧光淬灭。的引物自猝灭通过折叠和结合到短互补序列已被附加到5'引物序列?ΕΜΕ的末端。
[0014]传统的双标探针在设计上要有选择性，并且价格昂贵，合成起来非常困难。合成后需要手工加入至少一种标记物并要求高压液相色谱纯化。TAQMAN.RTM和分子信标探针需要两个结合在探针两端的反向引物。为了在退火阶段有效发挥功能，TAQMAN.RTM和分子信标探针必须更长，Tm(熔融温度)比引物的Tm高5至10度，因为在延伸之前探针必须牢固结合在靶基因上。这些就导致难以设计和开发检测SNP(单核苷酸多态性)或单碱基突变的双荧光探针。因此，假阳性是一个共同的问题困难。
[0015]FISH(荧光原位杂交)的探针技术需要:1)标记的DNA探针，2)探针杂交到已固定的变性靶标上，3)严格洗涤未结合的探针，和4)荧光的激发和检测(Barch M.J, editor.The ACT Cytogenetics Laboratory Manual 2nded.New York:Raven Press ;1991)。
[0016]基因芯片检测类似FISH检测。通常将寡核苷酸cDNA探针排列在载体基质上。将靶基因DNA或RNA用荧光标记后与探针杂交；经严格洗涤后进行检测，通常由激光扫描仪来检测(Schena et al.，(1995) Science270:467-470 ；Heller et al.，(1997) Proc.Natl.Acad.Sc1.US.A.94:2150-2155)。与FISH技术相同，洗步骤复杂且耗时。更重要的是，准备和标记目的基因的价格昂贵，因为每个样本都是是独一无二的，因此，基于微阵列的检测技术在临床诊断上价值有限。
[0017]因此需要更有效和更可靠的探针来检测核酸。由于qPCR法容易出现假阳性和阴性，因此当这种技术应用于临床分子诊断时，可能导致对病人制定有害的治疗方案。尤其是当前的技术在多探针系统中还存在缺陷。多探针系统通过在一个分析系统中同时检测2个或者更多个诊断靶序列来弥补假阴性和假阳性的缺陷。本项发明能够满足这些长远的需求。
[0018]摘要
[0019]本发明提供的探针系统适合于实时和终点检测DNA或RNA序列，包括区分单个碱基变异，如SNP和点突变的探针。本公开中主要包括有效用于实时定量PCR(qPCR的)的探针系统。实时定量PCR就是将小片段基因以指数扩增，在扩增期间其频度由荧光信号来检测。本公开也提供多探针方法。在一个分析中联合使用2个或多个探针，靶向一个物种或基因中的两个或更多个标识序列，以改善检测的确定性和/或信号容量。当检测一个扩增子中两个或更多序列时，该技术就更有使用价值了。此外，本发明提供多探针系统的诊断成分。由于多探针系统在一个分析中检测多个相关目的序列中的优势，而在诊断特定疾病和癌症方面有更高的敏感性和可信赖性。这些探针系统可应用于研究，生物药学及生命科学中各种不同的方面。
[0020]尤为特别的是，目前的发明直指多探针系统，以改善实时定量PCR及其他扩增方法中检测一个属种，一个基因或者其他相关核酸靶序列时的荧光信号或者检测的可靠性。该探针系统包括:(1)两个或者多个与样本中2个或多个相关的标识序列互补的探针。探针与信号放大器有相同的标记物，或者不同的标记物以明确检测，或者同时有相同和不同的标记物。探针包含一个或多个探针:反探针系统，其从含有iDDS探针，iDDS-2Q探针，MacMan探针，Flip 探针，通用探针(Universal probes)，半通用探针(Half-Universal probes),ZIPR探针，和G-Force探针中选取。多探针系统也包括(2)两侧引物成分，包括2个引物，一个引物或一个引物探针，或者两个引物探针。
[0021]本发明也指向一个相关的多探针系统，包含一个或多个可替换的探针，这些探针来自 TaqMan 探针，分子信标探针(Molecular Beacon probes), Scorp1n 探针，LUX 探针，Sunrise探针和双杂交探针(Dual Hybridizat1n probes)。多探针系统中的探针可以被可替换探针所替代。
[0022]本发明也明确改善检测信号和/或检测可靠性的方法。这个方法包括获得人体，动物或者生物标本，用标记的探针接触生物标本，两侧引物的成分，当生物样本与标记探针结合时，检测标记物释放的信号。如果标记的探针包含相同的标记物时，信号被放大，改善了检测信号的强度。如果探针标记物不同，那么能对检测结果进行验证，因此改善了检测的可靠性，同样，如果同时标记相同或不同标记物时，能同时增加检测信号的强度和检测可靠性。
[0023]简要描述
[0024]图1.系统解释例1中的多探针系统，包括2个iDDS_2Q探针:同时应用反探针系统来靶向检测粪肠球菌中的vanA基因。一个探针(P1-2Q)靶向反义序列，另一个探针(P2-2Q)靶向正义序列。黑色圆形代表吸收荧光的淬灭剂。灰白色圆形代表不同颜色的荧光发射分子。在这一组合中，与双探针结合的2个模板序列位于模板两端引物标记的序列之内。在传统的杂交条件下，在qPCR的退火阶段，双淬灭剂标记的探针(iDDS_2Q)首先与完全匹配的模板结合，从而释放荧光信号。淬灭剂标记的反探针(API和AP2)的作用是阻止探针与错误匹配的模板结合。为达到这一目的，这种反探针将关闭那些没有正确结合到靶基因上的探针。另外，探针3’端上的第二淬灭剂也能消除所有未结合到靶基因上的探针的信号，从而进一步减少背景信号。因此，这些探针提供高敏感性荧光信号，并通过同时平行检测2个相关的靶标序列而不断验证检测的准确性。
[0025]图2.显示的是利用特异性iDDS_2Q探针对耐万古霉素的粪肠球菌vanA基因进行qPCR扩增所产生的荧光信号曲线图(参见图1中的方案1)。该曲线图来自于两个管子中样本的扩增。每管都有两个vanA探针。第一管是vanA阳性模板，曲线1和曲线2显示第一管样本的扩增和阳性信号图。第二管是vanB对照模板，两条扁平曲线表明检测不到vanB的扩增。需要注意vanA探针1标记由橘色焚光(CalFluor0range560)，vanA探针2标记为红色荧光(CalFluorRed610)，探针1发出的信号高于探针2发出的信号。然而，2个阳性信号通常在qPCR循环中相同的时间点开始升高，因此他们的CT值相同。大部分qPCR仪器，通过调整其获得设置来平衡不同荧光发出的信号水平。在这种获得性调整的基础上进行大规模的验证性研究。即采用vanA双探针对182例院内标本进行检测以筛查vanA感染情况。结果是:采用双iDDS-2Q探针准确检测出24例阳性标本，用CT值检测的iDDS_2Q双探针的阳性信号是相同的。仪器检测的CT值相当接近(均差?0.32CT，大多数变种?0.6CT的差异)，又验证了这一结论。
[0026]图3示出在一个管内加入双iDDS_2Q探针通过qPCR生成的荧光曲线的另一个示例(类似于图1的方案)；在这种情况下，由一对引物扩增这两个探针位点。同样，两个探针标有不同的颜色的荧光，并且靶向阴道毛滴虫(T.vag.)重复性DNA序列中相邻的标识序列。阴道毛滴虫的检测是该类感染性疾病的诊断基础。曲线1和2表示含有T.vag阳性标本的2个阳性探针信号，而两个平曲线来自于含有人类基因组DNA的第二管对照样品。同vanA的测定相同，阳性曲线的高度不同，但CT值基本相同。在另一个大规模病例(η = 186)的验证研究中，27例样本中发现T.vag,且CT值仅差0.3CT (最大差异0.6)。双iDDS_2Q法的检测敏感性是标准显微镜下“液体涂片”的3倍，传统方法仅测出9例阳性标本。
[0027]图4A显示使用双iDDS_2Q探针的qPCR荧光曲线。该双探针特异性针对(a) EGFR21外显子L858R突变位点，或者(b)野生EGFR L858位点序列。每个探针标记不同荧光。曲线1显示用突变特异性探针检测含有100% L858突变样本的检测情况。尽管2中探针使用相同的引物对，但野生型探针(曲线2)并没有给出假阳性信号。因此，这种双探针法可明确分辨单碱基的差异。
[0028]图4B示qPCR荧光图谱。所用探针与图4A相同，但所用仪器不同。在这种情况下，在一个管子内将野生型EGFR和L858R突变型EGFR模板按50/50混合后，加入双探针上机运行检测。阳性曲线1和2在角度及高度上非常相似，而2个平坦曲线为完全相同的2个探针在以水为对照管的第二管中的检测情况。
[0029]图5A显示使用特异于野生型人类EGFR的双iDDS_2Q探针通过qPCR产生荧光曲线。探针1检测与肺癌相关的19号外显子的突变情况，探针2检测EGFR19号外显子缺失位点上游的参考序列的。每个探针标记不同的荧光，并且，他们在一个侧引物对标记的序列内。这是一个反向检测突变频率的方法，因为普通的探针不能检测靶基因上多个不同的缺失。探针1只检测野生型19号外显子，不能检测19号外显子缺失突变。已知与癌症相关的19号外显子通常表现为15号碱基的缺失，但9-24号碱基都有可能缺失。探针2，参考探针，检测EGFR所有扩增子，不管有无19号缺失。因此，探针1与探针2之间的信号比例就反映了样本中有19号外显子缺失的相对量。在图示样本中，双探针检测的是一个100%野生型EGFR样本，因此两条曲线是并行的。
[0030]图5B显示使用与图5A相同的探针通过qPCR产生两条荧光曲线。在这种情况下，反应体系中包含以50/50混合的野生型EGFR和19号缺失的EGFR模板。因此野生型样本的曲线较参考曲线低50%。此法能容易的检测含20-50% EGFR突变细胞的病人样本。
[0031]图5C.显示使用与图5A相同的探针通过qPCR产生两条荧光曲线。在这种情况下，反应体系中含有100%的EGFR缺失突变的模板。参考探针，探针1只正向检测EGFR缺失突变体模板，尽管突变体序列存在。与此相反，探针2显示了一个平坦的曲线，表示所有的扩增子都有突变，在诊断性突变位点上没有发现野生型序列。
[0032]图.6所示的使用两个探针对肠道病毒有诊断意义的5'非编码区(UTR)的1DDS-2Q探针，通过qPCR产生两种荧光曲线。将探针末端连接一对引物，这两对引物在靶序列上部分重叠，分别检测正义链和反义链。阳性曲线1和2反映的是用双探针对一个管中EV阳性样本的检测结果。两条平坦曲线反映的是用两个EV探针对另一个管中人类基因组DNA对照样品的检测情况。
[0033]图.7所示的使用特异于副肠孤病毒(parechovirus)的有诊断意义的5'非编码区(PV)的两个2iDDS_2Q探针，通过qPCR产生两种荧光曲线。曲线1，2反映用两个探针检测一个管中PV阳性样品的信号。两平坦曲线反映的是用两个PV探针在另一个管中检测人类基因组DNA对照样品的检测情况。
[0034]本公开中涉及的方法和系统的一些示例将在下面详细描述。通过检测本公开中描述的内容，图谱，实例及声明，本领域技术人员可对本发明的其他特征，目的，和优点了如指掌。它意在将所有其他系统，方法，特征和优点被包括在本说明书内，包括在本公开的范围内，并且由所附的权利声明来保护。
[0035]公开的详细描述
[0036]在参考文献中包含了本描述中引用的所有文献，专利及专利使用。但是应当理解的是，本公开并不限于所描述的特定实例，也不局限于所描述的方法和使用的材料，并且，由于该公开的使用范围仅受权利声明的限制而导致内容和方法有所不同。这里描述的每一个实例都其独特特征，这些特征可能与其他实例的特征不同或者相联系，但并不违背该公开的精神和范围。所有引用的方法可按照引用事件的顺序实施，或者以任何逻辑上可行的顺序实施。除非另有定义，否则这里所用的所有术语与分子生物学领域中普通技术人员所理解的含义相同。这也是可以理解的是，本文所使用的术语仅用于描述具体实施方案的目的，并且不旨在进行限制，因为本公开的范围将由所附的权利要求来限定。
[0037]下列缩写:iDDS，内部的DNA检测开关；qPCR，定量PCR(实时PCR) ;LNA，锁核酸；BNA，桥连核酸；Tm，解链温度；SNP，单核苷酸多态性；CT，循环阈值。
[0038]术语“一”，与术语“包括”在要求和/或说明书中一起使用时，可以指“一”，但也可指“一个或多个”，“至少一个”，以及“一个或一个以上的”。本发明的一些实例可以包括或基本上包括一个或多个元件，组件，方法步骤，和/或本发明的方法。可以预期的是任何方法，化合物，组合物，系统，或本文描述的设备可相对于任何其他方法，化合物，组合物，系统，或在本文描述的设备中实现。
[0039]术语“或”，在声明中是指“和/或”，除非明确“or”仅指替代或替代品与原品是相互排斥的。公开支持“or”仅指替代品，以及使用“和/或”。
[0040]术语"大约” 一词是指一个数量值，无论是否明确指出，其包括整数，分数和百分数。术语“约”通常是指一个数值范围，例如，所引用的数值的+/-5-10%，即在本领域的普通技术人员将认为等同于所引用的数值，例如，具有相同的功能或结果。在一些情况下，术语“约”可包括四舍五入为最接近的数字.
[0041]术语“DNA扩增”和“扩增”是指任何通过酶扩增增加一个特定的DNA序列拷贝的方法。通常使用的方法是如美国专利号4，683，195和4，683，202中描述的聚合酶链反应(PCR)。
[0042]这里使用的“聚合酶链反应”和“PCR”是指在聚合酶的催化下以热循环的方式进行DNA扩增反应。DNA扩增反应需要核酸，与模板互补的寡核苷酸引物，热稳定性DNA聚酶，脱氧核糖核苷酸。
[0043]术语“qPCR”是指在PCR扩增过程中运用引物和标记的探针同时检测每个步骤产生的目的DNA分子数量的一种实时聚合酶链反应。
[0044]本文所用的术语“引物”指与被扩增或复制的DNA或RNA模板互补的寡核苷酸。引物与模板序列杂交或退火，并通过聚合酶来启动复制/扩增过程。
[0045]本文所用的术语“探针”是指长度可变的寡核苷酸。通过与靶基因杂交来检测相同，相似或互补的核酸序列。寡核苷酸探针通常被标记上可检测的物质如放射性，荧光或化学发光化合物。
[0046]本文所用的术语“荧光团”是指可以通过其发光特性而被检测到的任何报告基团。
[0047]本文所用的术语“淬灭剂”是指一种分子，它能够干扰或吸收由附近荧光团发射的荧光。
[0048]术语“互补”是指两个序列段之间有足够数量的匹配碱基存在，以便它们可以特异性结合或杂交。
[0049]术语“变性”是指通过热或变性剂处理，使双链DNA分离成为互补DNA单链。
[0050]本文所用的术语“杂交”是指两个核酸链通过氢键结合形成稳定的反向平行的双链体的过程。杂交链被称为“双链”。
[0051]术语“杂交亲和力”是指两个核酸片段间的化学亲和程度，取决于匹配的碱基对之间的结合，而杂交亲和力根据双链体的长度和序列的不同而有所变化。
[0052]本文所用的术语“错配碱基”是指在一个双链中，其中一个或多个反向核苷酸碱基与互补链不匹配。不匹配可能由于添加，缺失，或取代天然或非天然碱基，或间隔。
[0053]本文所用的术语“靶”和“靶核苷酸序列“是指期望检测的多核苷酸序列。
[0054]本文所用的术语“标签序列”是指一段靶核苷酸序列，该序列用以识别感兴趣的一个基因，物种，或有机体。
[0055]本文所用的术语“探针:反探针”指的是一对寡核苷酸序列，他们具有接近或者