恩（沧州宝恩吸附材料科技有限公司）产产30-60目（Β30-60)、60-100目（Β60-100) 聚酰胺12g装入Φ20X300mm层析柱中，取生药浓度1 : 10知母提取溶液40mL以2.OBV/h 流速通过聚酰胺树脂柱，然后分别以去离子水、10 %，20 %，30 %，40 %，50 %乙醇各60mL以 1.OBV/h进行洗脱，30mL分段进行收集，测定新芒果苷、芒果苷、知母皂苷B-II和知母皂苷 A-III。由表5可以看出，台州四甲产60-100目聚酰胺具有较好的分离效果。
[0042] 表5聚酰胺树脂规格、厂家和乙醇洗脱浓度
[0043]
[0044] 聚酰胺纯化工艺中上样质量的考察：
[0045] 取预处理好的台州四甲产60-100目聚酰胺粉12g装入Φ20X300mm层析柱中，取 生药浓度1 : 10知提取溶液20mL，60mL，100mL，140mL分别以2.OBV/h通过聚酰胺树脂柱， 然后分别以水、10 %、20 %、30 %、40 %和50 %乙醇1.OBV/h进行洗脱，60mL分段进行收集， 测定新芒果苷、芒果苷、知母皂苷B-II和知母皂苷A-III。由表6可以看出，水和20%乙醇 以前洗脱部位可以洗脱得到新芒果苷和知母皂苷B-II，30 % -50%部位可以得到芒果苷和 知母皂苷A-III，且随着上样量的增加新芒果苷、知母皂苷B-II部位和芒果苷和知母皂苷 A-III部位并不会重合，表现出较好的分离效果。但考虑到可能不同样品各成分的差异，为 保障分离效果，故上样体积定为不超过l〇〇mL，样后先以1BV的20%乙醇进行洗脱后，然后 以50 %乙醇进行洗脱。
[0046] 表6不同上样体积四种组分在台州四甲60-100上的洗脱特征
[0047]
[0048] 芒果苷、新芒果苷高效液相分析条件：
[0049] 流动相为0. 02%磷酸水和乙腈系统，梯度条件见表7,检测波长为258nm，柱温箱 温度 30°C，流速 1.OmL/min。
[0050] 表7芒果苷、新芒果苷高效液相流动相条件
[0051]
[0052] 知母皂苷BII、知母皂苷AllIHPLC:
[0053] 流动相为0. 05%甲酸水和乙腈系统，梯度条件见表8,检测器为ELSD检测器，柱温 箱温度30°C，流速1.OmL/min，漂移管温度110°C，载气流速2.OL/min，增益值2。
[0054] 表8知母皂苷BII、AllI高效液相流动相条件
[0055]
【附图说明】
[0056] 图1上样液和制备芒果苷、新芒果苷样品HPLC图
[0057] 图2上样液和制备知母皂苷BII、知母皂苷AIII样品HPLC图，检测器为ELSD
[0058] 图3四种组分在三种树脂上的洗脱特征
[0059] 图4不同上样体积四种组分在HPD400上的洗脱特征 [0060] 图5四种组分在不同厂家、不同规格聚酰胺柱上洗脱特征
[0061] 图6不同上样体积四种组分在台州四甲60-100目聚酰胺上的洗脱特征
[0062] 各图的具体解释
[0063] 图1的组成ABC(紫外检测器，检测波长258nm，A:上样前样品溶液，B:芒果苷溶 液，C:新芒果苷溶液）
[0064] 图2的组成ABC(检测器：ELSD，A:上样前样品溶液，B:知母皂苷BII溶液，C:知 母皂苷AllI溶液）
[0065] 图 3 的组成ABC(A:HPD100,B:HPD400,C:HPD600)
[0066] 图 4 的组成ABC(A:60mLB: 120mLC: 180mL)
[0067] 图5的组成ABCD(A:台州四甲30-60,B:台州四甲60-100,C:宝恩30-60,D:宝恩 60-100)
[0068] 图 6 的组成ABCD(A:20mL，B:60mL，C:100mL，D:120mL)
【具体实施方式】
[0069] 实施例1
[0070] 取500g知母药材粉碎成60目粉，5000mL的50%乙醇超声提取2次，每次0.5h，抽 滤，合并提取液，回收至无醇味，加水至3000ml，以2BV/h流速通过30-60目聚酰胺柱层析 柱，续以2倍柱体积的15%乙醇以lBV/h流速洗脱，然后以2倍柱体积的40%乙醇以1BV/ h流速洗脱，合并上样后流出液和15 %洗脱液，回收乙醇，加水至lOOOmL，记作样1 ;回收 40%乙醇洗脱部分除去乙醇，加水至2000mL充分溶解，记作样2。样1以2BV/h流速通过 HPD-400大孔树脂层析柱，分别用1. 5倍柱体积的10%乙醇、20%乙醇、30%乙醇、40%乙醇 以1BV/流速洗脱，分别回收20 %乙醇洗脱部位、40 %乙醇洗脱部位后冻干，分别得到新芒 果苷0. 55g、知母皂苷BII9. 53g;样2以2BV/h流速通过的HPD-400大孔树脂柱层析柱，分 别用1. 5倍量20 %乙醇、30 %乙醇、60 %乙醇、70 %乙醇洗脱，分别回收30 %乙醇洗脱部位、 70%乙醇洗脱部位后冻干，分别得到芒果苷1. 61g、知母皂苷AIII2. 13g;
[0071] 实施例2
[0072] 取1000g知母药材粉碎成60目粉，lOOOOmL的70%乙醇回流提取2次，每次2h， 抽滤，合并提取液，回收至无醇味，加水至4000ml，以2BV/h流速通过的60-100目聚酰胺柱 层析柱，续以2倍柱体积的10%乙醇以lBV/h流速洗脱，然后以2倍柱体积的50%乙醇以 1BV(/h流速洗脱，合并上样后流出液和20%洗脱液，回收乙醇，加水至2000mL，记作样1 ;回 收40%乙醇洗脱部分除去乙醇，加水至2000mL充分溶解，记作样2。样1以2BV/h流速通 过的HPD-100柱层析柱，分别用2倍柱体积的10%乙醇、20%乙醇、30%乙醇、40%乙醇以 1BV/流速洗脱，分别回收20 %乙醇洗脱部位、40 %乙醇洗脱部位后冻干，分别得到新芒果 苷1. 23g、知母皂苷BII17. 56g;样2以2BV/h流速通过HPD-100树脂层析柱，分别用2倍 量30 %乙醇、60 %乙醇、70 %乙醇洗脱，分别回收30 %乙醇洗脱部位、70 %乙醇洗脱部位后 冻干，分别得到芒果苷3. 60g，知母皂苷All13. 52g。
[0073] 实施例3
[0074] 取1000g知母饮片粉碎成10目粗粉，8000mL的70%乙醇回流提取2次，每次3h， 抽滤，合并提取液，回收至无醇味，加水至4000ml，以2BV/h流速通过800mL的30-60目聚 酰胺柱层析柱，续以2倍柱体积的20%乙醇以lBV/h流速洗脱，然后以2倍柱体积的50% 乙醇以lBV/h流速洗脱，合并上样后流出液和20%洗脱液，回收乙醇，加水至2000mL，记作 样1 ;回收50%乙醇洗脱部分除去乙醇，加水至2000mL充分溶解，记作样2。样1以2BV/h 流速通过D-101树脂层析柱，分别用2倍柱体积的10%乙醇、20%乙醇、30%乙醇、40%乙 醇以1BV/流速洗脱，分别回收20%乙醇洗脱部位、40%乙醇洗脱部位乙醇后真空干燥，分 别得到新芒果苷1. 58g、知母皂苷BII21. 54g;样2以2BV/h流速通过D-101树脂层析柱， 分别用2倍量20 %乙醇、30 %乙醇、60 %乙醇、70 %乙醇洗脱，分别回收30 %乙醇洗脱部位、 70%乙醇洗脱部位乙醇后真空干燥，分别得到芒果苷3. 01g、知母皂苷AIII3. 25g。
【主权项】
1. 一种同时制备知母中四种药效成分的方法，其特征在于：聚酰胺-大孔树脂柱连用， 同时分离制备知母中新芒果苷、芒果苷、知母皂苷BII和知母皂苷AIII的方法。2. 如权利要求1所述的方法，其特征在于：知母用乙醇提取，知母乙醇提取物用聚酰胺 吸附，水洗除杂，用乙醇洗脱；乙醇洗脱物浓缩后，然后加到大孔树脂柱中，用乙醇洗脱，制 备得到知母中四种药效成分。3. 如权利要求1所述的方法，其特征在于：先通过聚酰胺洗脱，再通过大孔树脂柱洗 脱，同时分离制备知母中新芒果苷、芒果苷、知母皂苷BII和知母皂苷AIII的方法；聚酰 胺采用5% -20 %乙醇和40% -60 %乙醇溶剂1-5BV洗脱；大孔树脂柱采用低浓度乙醇为 20% -30%乙醇，中浓度乙醇为50% -60%乙醇，高浓度乙醇为70% -80%乙醇洗脱。4. 如权利要求1所述的方法，其特征在于：包括以下步骤 a) 将市售的知母药材或饮片直接投料或粉碎成粗粉，以3-10倍体积的30 % -80 %的乙 醇室温超声提取1-3次，每次0. 5-lh，或者通过加热方式超声提取或回流提取1-3次，每次 l-3h，过滤，合并提取液回收乙醇后加水溶解到适当体积，得提取液； b) 上述提取液通过预处理好的聚酰胺柱，先后采用5 % -20 %乙醇和40 % -60 %乙醇溶 剂1-5BV洗脱。第一部分包括上样流出溶液和5% -20%乙醇洗脱溶液，记作样1 ;第二部 分为40 % -60 %乙醇洗脱溶液，记作样2 ; c) 取样1浓缩至无醇味，加水至3-10倍体积至充分溶解，通过大孔吸附树脂柱，分别用 水、不同浓度乙醇洗脱；收集低浓度乙醇洗脱部位，记作样3,中浓度洗脱部位，记作样4 ; d) 取样2浓缩到无醇味，加水适量至充分溶解，通过大孔吸附树脂柱，分别以低浓度、 中浓度和高浓度乙醇洗脱，收集低浓度醇洗脱部位，记作样5 ;高浓度乙醇洗脱部位，记作 样6 ; e) 取样3、样4、样5、样6,浓缩，干燥，分别得到新芒果苷、知母皂苷BII、芒果苷和知母 皂苷AIII。5. 如权利要求1所述的方法，其特征在于：是通过两种分离材料的联用实现分离，即样 品是先通过聚酰胺，不同部位洗脱液回收醇后分别通过大孔吸附树脂分段收集。6. 如权利要求1要求所述的方法，其特征在于：b)中聚酰胺为30-60目或者60-100目。7. 如权利要求1要求所述的方法，其特征在于：c)中大孔吸附树脂为中极性、弱极性或 非极性吸附树脂，低浓度乙醇为10-30%乙醇，中浓度乙醇为40% -50%乙醇。8. 如权利要求1要求所述的方法，其特征在于：d)中大孔吸附树脂为中极性、弱极性或 非极性吸附树脂，低浓度乙醇为20% -30%乙醇，中浓度乙醇为50% -60%乙醇，高浓度乙 醇为70% -80 %乙醇。9. 如权利要求1要求所述的方法，其特征在于：上样速度为l_3BV/h，洗脱流速1-2BV， 洗脱剂体积为柱体积的1-3倍。
【专利摘要】本发明公开了一种同时分离制备知母中主要化学组分新芒果苷、芒果苷、知母皂苷BII和知母皂苷AIII的工艺方法，通过组合聚酰胺和大孔吸附树脂，通过分段收集，可以有效的分离制备此四种成分。本工艺对环境友好，树脂和聚酰胺可以重复利用，生产成本低，制备得到的样品纯度在90％以上，并且可以实现规模化生产。
【IPC分类】C07D407/04, C07H17/04, C07J75/00, C07H1/08, C07J71/00
【公开号】CN105330709
【申请号】CN201510328951
【发明人】李萍, 李会军, 年四辉
【申请人】中国药科大学
【公开日】2016年2月17日
【申请日】2015年6月10日