r>[0031] 一种非对称转座子，其序列（命名为MuCDM)为SEQIDNO. 1，其制备方法为：通过 全基因合成（苏州金唯智生物科技有限公司）非对称转座子的模板DNA序列，其两端序列 带有BglII酶切位点。将上述的非对称转座子模板DNA序列插入PUC19质粒（苏州金唯 智生物科技有限公司）中，得到含有转座子的PUC19质粒（命名为pUC19-MuCDM)，转化进 D册α大肠杆菌巧scherichiacoli)中进行扩增（苏州金唯智生物科技有限公司），对扩 增获得的含有转座子的PUC19质粒（pUC19-MuCDM)进行BglII酶切，并用琼脂糖凝胶电泳 分离1. 4化转座子片段（移除2. 6化质粒骨架片段），可获得含有5'GATC粘性末端的非 对称转座子（MuCDM)(图IA)，用于转座子反应。
[0032] 应用上述的非对称转座子对目的蛋白基因进行随机密码子缺失，构建GFPw基因 的密码子缺失突变文库，具体实验步骤如下（流程大纲见图2):
[0033] 1.将GFPw克隆进转座子目标质粒ρΤΤ，构建成pTT-GFPW质粒（SEQIDNO. 2)(苏 州金唯智生物科技有限公司，合成及克隆）（图1B)。
[0034] 2.将纯化的转座子、含有目的基因的ρΤΤ质粒与转座酶在缓冲液中混合进行转座 子反应：设置10μL转座子反应：其中包含42化gpTT-GFPw质粒，125ng琼脂糖凝胶电泳分 离纯化的MuCDM转座子，1单位的HyperMuMuA转座酶巧picentreBiotechnologies)，反 应的溶液为50mM的Ξ径甲基氨基甲烧-醋酸缓冲液（pH7. 5)，含有150mM醋酸钟，lOmM醋 酸儀及4mM亚精胺。反应在30°C进行4小时，然后用0. 1 %十二烷基横酸钢终止，并在70°C 热灭活10分钟。
[0035] 用氨节青霉素/卡那霉素双抗性对读码框内的转座子插入进行筛选（原理如图 1C所示），具体步骤为：将转座子反应产物在冰上解育5分钟，然后将1μL产物与200μL 电转化大肠杆菌感受态细胞（安捷伦）混合，用电转化仪（伯乐）进行电击，并立即加入1 毫升LB培养基。将转化的细胞在37°C复苏1小时后，均匀涂在含有50μg/mL卡那霉素及 40μg/mL氨节青霉素的LB平板上，30°C培养过夜。第二天，收集5000个菌落，提取其质粒 DNA，构建转座子随机插入文库pTTGFPw-MuCDM。
[0036] 3.W转座子文库DM为模板，根据要缺失密码子数目用相应引物（图3)进行PCR 扩增，并对PCR产物进行纯化，具体步骤为：
[0037] 用获得pTTGFPuv-MuCDM文库作为模板进行反向PCR。PCR反应体系包括12. 5pg/ μL模板，正向及反向引物各0. 5μΜ(见下说明），0. 2mM的dNTPs，0. 005U/μL的fusion DNA聚合酶（肥B)，1X化usionHF缓冲液（肥B，含有1. 5mM氯化儀），W及额外2mM硫酸儀。 PCR反应条件为：98°C热变性2分钟，18个循环的98°C10秒，59°C30秒及72°C2. 5分钟， 最后在72°C进行延伸10分钟。反应产物用PCR产物纯化试剂盒（Qiagen)进行纯化。本发 明包含针对非对称转座子设计的2条正向引物及4条反向引物（图3)。此实施例中，通过 组合不同的引物对实现了对GFPw基因缺失突变1至5个密码子。具体组合如下：
[0038] 1密码子缺失：引物FWD8N/REV0N
[0039] 2密码子缺失：引物FWD8N/REV3N
[0040] 3密码子缺失：引物FWD8N/REV6N
[0041] 4密码子缺失：引物FWD8N/REV9N
[0042] 5密码子缺失：引物FWD11N/REV9N。
[0043] 4.将纯化的PCR产物依次进行BsgI酶切和平末端处理，然后进行连接反应，得到 缺失突变文库。具体步骤为：
[0044] 将纯化的PCR产物进行BsgI酶切，其50μL反应体系包括400ng的PCR产物，6U 的Bsgl限制性内切酶（肥B)，80μΜ新鲜配制S-腺巧甲硫氨酸（肥B)，20mMΞ径甲基氨基 甲烧-醋酸（pH7. 9)，50mM醋酸钟，lOmM醋酸儀W及ImM的二硫苏糖醇（肥B)。酶切反应 在37°C进行4小时，然后在65°C热灭活20分钟。
[0045] 反应产物冷却至室溫，然后进行平末端处理：在酶切的50μΙ反应体系中直接加 入dNTPs(肥Β)至33μΜ终浓度，并加入0.抓的Klenow酶（肥Β)。平末端反应在25°C进行 15分钟，然后加入1. 1μL的0.5M邸TA(pH8.0;Sigma公司）进行终止，并在75°C热灭活 20分钟。热灭活反应产物加入4U的化ηI(肥B)，并在37°C解育80分钟移除PCR模板DNA。 反应产物用胶纯化试剂盒（Qiagen)进行纯化。图4W1密码子缺失突变为例，说明了特定 数目核巧酸如何从目的基因中移除。
[0046] 对纯化的酶切产物进行连接反应：10μL反应体系包括2. 5ng/μL纯化的酶切产 物，0.IWeiss单位的T4DNA连接酶（肥B)，40mMS^甲基氨基甲烧-盐酸加7.8)缓冲液， lOmM氯化儀，lOmM二硫苏糖醇W及0. 5mM腺嚷岭核巧Ξ憐酸（肥B)。连接反应在16°C进行 8小时后在70°C热灭活6分钟。按步骤2中描述将连接产物转化进电转化大肠杆菌感受态 细胞（安捷伦）。37°C复苏1小时后，将大肠杆菌涂抹在含有50μg/mL的LB平板上，37°C 培养过夜。第二天，对5个密码子缺失文库各收集5000个菌落构建缺失突变文库如图5所 /J、- 〇
[0047] 从1至5密码子缺失突变文库中各选取20个菌落克隆进行DNA测序验证，分析缺 失突变类型，总体正确率为92. 3%巧6/104)。
[0048]沈QIDNO. 1 :
[0049]
阳ο加]沈Q IDNO. 2 :
[0051]
[0052]
[0053]
【主权项】
1. 一种非对称转座子，其特征在于，其序列为SEQIDNO. 1。2. 权利要求1所述的非对称转座子的应用方法，其特征在于，包括： 步骤1.将目的基因克隆至转座子目标质粒得到含有目的基因的质粒； 步骤2.将转座子、含有目的基因的质粒与转座酶在缓冲液中混合进行转座子反应；将 转座反应产物转化进大肠杆菌感受态细胞，用氨苄青霉素/卡那霉素双抗性对读码框内的 转座子插入进行筛选；收集获得菌落，提取质粒DNA，此为转座子随机插入文库； 步骤3.以转座子随机插入文库DNA为模板，根据要缺失密码子数目用相应引物进行PCR扩增，并对PCR产物进行纯化； 步骤4.将纯化的PCR产物依次进行BsgI酶切和平末端处理，然后进行连接反应，得 到缺失突变文库。3. 如权利要求2所述的非对称转座子的应用方法，其特征在于，所述的目标质粒的序 列为SEQIDNO. 2。
【专利摘要】本发明提供了一种非对称转座子及其应用。所述的非对称转座子的应用方法包括：将目的基因克隆至转座子目标质粒；将纯化的转座子、含有目的基因的质粒与转座酶在缓冲液中混合进行转座子反应；将转座反应产物转化进大肠杆菌感受态细胞，对读码框内的转座子插入进行筛选；收集获得菌落，提取质粒DNA，此为转座子随机插入文库；以转座子随机插入文库DNA为模板，进行PCR扩增，将纯化的PCR产物依次进行Bsg？I酶切和平末端处理，然后进行连接反应，得到缺失突变文库。本发明可实现1至5个氨基酸缺失。
【IPC分类】C12N15/11, C12N15/10, C40B50/06
【公开号】CN105368832
【申请号】CN201510898429
【发明人】刘佳, 姜标, 刘淑素
【申请人】上海科技大学
【公开日】2016年3月2日
【申请日】2015年12月8日