单细胞捕获芯片的制作方法
【技术领域】
[0001]本发明属于微流控技术领域，特别是涉及一种单细胞捕获芯片。
【背景技术】
[0002]随着生物技术研究手段的不断发展，生物学的研究层面正从细胞种群向单细胞层面深化拓展。每个细胞在时空上都是独一无二的，尽管它们可能来自同一祖先，但是不同的时空环境决定了它们各自特异的遗传表达，从而产生了不同的生物性状，这对于进化、耐药性、基因表达等研究具有重要价值。然而基于细胞种群的分析方法往往会掩盖群体内不同细胞间出现的差异，忽略这些少量但重要的信息。因此迫切需要研发基于单细胞的培养及分析方法，用来研究不同细胞个体间的差异性，了解细胞的遗传与代谢机制。
[0003]从大量细胞中获得单个细胞是进行单细胞培养与分析的第一步。传统的单细胞获取方法常采用对细胞群进行大量稀释或者显微操作的方法来进行。整个操作步骤复杂繁琐，单细胞获得效率低。微流控技术是上世纪九十年代在分析化学领域发展起来的，它以微管道网络微结构特征，通过微加工技术将微管道、微泵、微阀、微储液器、微检测元件等功能元器件像集成电路一样，集成在芯片材料上。微流控技术在分离捕获单细胞方面很高的效率，通过在芯片上制作微孔、微筛、微电极等结构，能够在较短时间捕获大量单细胞，在单细胞捕获培养研究方面已经有多个成功的应用范例。
[0004]美国专利申请US20120009671A1中描述了一种基于微孔的单细胞捕获方案，该芯片上有上千个160 μ?? (长)X 160 μ?? (宽)X 160 μπι (深)的微孔，各微孔顶部均有液流通道相连，捕获前，先将细胞浓度稀释到合适水平，然后将稀释的细胞液注入液流通道，使各微孔充满液体后停止注入细胞液，此时液流通道中的细胞在重力作用下沉入微孔，通过调整细胞液的稀释度可以确保约有10%~30%的微孔中含有单个细胞。捕获的单细胞在微孔中进行培养，培养液更换则通过以每秒2 _的速度注入培养液来实现。此芯片能够实现160~480个单元的单细胞培养。
[0005]针对上述单细胞捕获方案，由于单个细胞捕获是基于单细胞在平面上的均匀分布实现的，这就需要调整输入细胞的浓度，使单个微孔的水平区域仅含有一个细胞，尽管如此，多数微孔或是未捕获到细胞，或是捕获到两个及以上的细胞，能够捕获到单个细胞的微孔数量比例仍然比较低(10~30%)。而且，微孔中细胞捕获数量的不确定性使得必须要通过显微成像对所有微孔区域的细胞数量进行判别，从中挑出少数具有单个细胞的微孔，整个判别过程耗时且工作量比较大。另外，由于仅靠重力将单细胞捕获在微孔中，捕获力较弱，细胞容易随高流速的液流而流失，因此在培养液换液时，液流流速需要控制在每秒2mm以下，这增加实验过程的复杂性，提高操作难度大。从总体看，由于细胞捕获依赖于微孔中的流场分布，这对于微孔的形制有较大要求；由于微孔不仅作为捕获结构，还需要作为培养结构，因此特定的微孔形制也决定了有限的细胞培养空间结构。
[0006]已公开的技术文献(Lab Chip, 2012，12，765)公开了一种基于微筛的单细胞捕获芯片，该芯片具有多个串联圆形腔室，每个腔室中央有一对由两个微柱组成的微筛结构。当细胞注入腔室时，单个细胞会被阻滞于微筛处，从而被捕获，进而微筛外围的上方的圆形微阀通过加压，阀膜向下方的液流通道弯曲形变，将微筛区域与外界液流通道隔离，形成一独立腔室，捕获的单细胞即在其中培养生长。换液操作时，微阀开放数百毫秒后再次快速关闭，微阀隔离区域外的新液在此数百毫秒短时间内扩散进入微阀隔离区域内。
[0007]由于单细胞捕获力为微筛对流动中细胞的反作用力，捕获力强弱与液体流速密切相关，较强的细胞捕获依赖于较高的液体流速。在改变注入液体种类时，管道中的液流速度容易产生波动或或发生瞬时流向改变，此时细胞极易从微筛上脱离造成捕获失败，因此该方案对液体流速控制要求较高。换液操作时，外部新液依靠微阀瞬时开放(数百毫秒)而扩散进入中央区域，这对微阀开放时间的控制要求极高。而且依靠浓度差扩散进入的新液量十分有限，内外液体更换是不完全的，当中央隔离培养区域直径增大时，依靠扩散进行换液的效果将下降。
【发明内容】
[0008]本发明的主要目的在于提出一种单细胞捕获芯片，该芯片单细胞捕获力较强，被捕获细胞不易从捕获位点脱离，能够从有限数量的细胞中，通过冲洗操作可以方便的得到单细胞，并可快速更换单细胞的环境溶液。
[0009]为了达成前述发明目的，本发明采用的技术方案如下:
一种单细胞捕获芯片，包括:
液流层，包含液流通道，所述液流通道分别通过液流输入管道、液流输出管道的接口与芯片外部连通，
弹性膜层，包括设置在所述液流通道上的弹性膜，
驱动机构，至少用以驱使所述弹性膜的局部区域产生趋向所述液流通道的形变和/或位移，从而在所述弹性膜层与液流层之间形成用于截留流经所述液流通道的液流内单个细胞的细胞空穴。
[0010]进一步的，所述弹性膜分布于所述液流层与驱动机构之间，使所述驱动机构与液流通道相互隔离。
[0011 ] 进一步的，所述驱动机构至少可选自电致动机构、磁致动机构、光致动机构、液压驱动机构或气动机构，且不限于此。
[0012]在一实施方案之中，所述驱动机构包括设置在弹性膜层上的气动控制层。
[0013]进一步地，所述细胞空穴的大小与单个细胞的直径等于或者略小于单个细胞的直径。
[0014]进一步地，所述弹性膜层包括设置在液流通道上的弹性膜，所述弹性膜将液流通道与气动控制层隔离。
[0015]进一步地，所述气动控制层包括设置在弹性膜上的气动控制管道，所述气动控制层根据气动控制管道内的流体压力控制弹性膜的形变和/或位移，从而在所述弹性膜与液流层之间形成所述细胞空穴。
[0016]其中，至少所述气动控制管道的局部区域与所述液流通道交叉，特别是，所述气动控制管道至少在所述液流通道内的细胞空穴上方穿越。
[0017]在本发明中，通过驱动机构驱使所述弹性膜的局部区域产生趋向所述液流通道的形变和/或位移，使弹性膜的局部位点，例如离散分布的多个位点凸露至液流通道，从而可在所述弹性膜层与液流层之间形成用于截留流经所述液流通道的液流内单个细胞的细胞空穴。
[0018]而作为较佳实施方案之一，可在所述液流通道内固定连接复数个凸起部，当所述弹性膜产生趋向所述液流通道的形变和/或位移，特别是相对微小的形变和/或位移时，在所述弹性膜与液流通道之间于相邻设置的复数个凸起部之间形成所述细胞空穴。
[0019]作为较佳实施方案之一，所述弹性膜暴露于所述液流通道内的局部表面上固定连接有复数个凸起部，当所述弹性膜产生趋向液流通道的形变和/或位移时，在所述弹性膜与液流通道之间于相邻设置的复数个凸起部之间形成所述细胞空穴。
[0020]较为优选的，当所述弹性膜产生趋向液流通道的形变和/或位移时，在所述弹性膜与液流通道之间于相邻设置且呈环形布局的复数个凸起部之间形成所述细胞空穴。
[0021]在一典型实施案例中，当所述弹性膜产生趋向液流通道的形变和/或位移时，在所述弹性膜与液流通道之间于相邻设置且呈三角环形布局的三个凸起部之间形成有所述细胞空穴。
[0022]作为较佳实施方案之一，所述液流通道内固定连接有M个第一凸起部，同时所述弹性膜暴露于所述液流通道内的局部表面上固定连接有N个第二凸起部，当所述弹性膜产生趋向液流通道的形变或位移时，所述弹性膜与液流通道之间在相邻设置的复数个第一凸起部之间和/或相邻设置的复数个第二凸起部之间和/或相邻设置的m个第一凸起部与η个第二凸起部之间形成所述细胞空穴，M、N、m、n均为正整数，并且M与N不同时等于l，m与η不同时等于I。