原菌菌落半径）。
[0040] 5个菌株对大丽轮枝菌菌丝抑制效果如表2所示，其中，SX-3对大丽轮枝菌菌丝生 长具有最强的抑制效果，抑制率达8 6.7 %。显微检查抑制位点的菌丝发现，菌丝生长被抑 制，不形成轮枝，菌落边沿菌丝出现簇状聚集(图5)，聚集菌丝呈现球状膨大现象(图6)。
[0041 ]表2生防菌株对菌丝生长的抑制作用。
[0043]实施例2菌株的鉴定
[0044] 对筛选效果最好的菌株SX-3进行鉴定。
[0045] 形态学鉴定
[0046] 菌株在LB培养基上菌落表面光滑，呈乳白色（图1)。染色试验测定为革兰氏阳性 菌。扫描电镜下为杆状细菌，大小为0.58X2.9μπι(图2)。
[0047] 16SrDNA序列分析
[0048]将菌株接种于NA培养液(酵母粉lg/L，牛肉膏3g/L，蛋白胨5g/L，鹿糖10g/L，pH = 7.0)中，在30°C、180rpm培养120小时后，进行DNA提取；采用16S rDNA通用引物进行PCR扩 增，获得大约1400bp的电泳条带，回收后由生工生物工程有限公司（上海)完成测序。将所测 定的16SrDNA序列与GenBank数据库中序列进行比较分析，确定其分类地位。
[0049] 16SrDNA测序，比较和编辑后获得1430bp(如SEQIDN0.1所示），该序列用Blast 搜索和比较分析显示，SX-3菌株与多粘类芽孢杆菌（？3611；^3〇；[11118?017111713)序列 (861^&吐号：1849658.1或10?010176.1)-致性为99%。
[0050]脂肪酸测定
[00511脂肪酸测定采用全自动微生物鉴定系统(美国Agilent6890型气相色谱系统），按 照MIDI公司说明书上的方法进行。将菌株先在NA培养基上于28°C下生长24h后，转入含3% 胰蛋白酶的TSBA固体培养基上再培养24h。然后用直径4mm的无菌塑料接种环挑取一环培养 菌放入有螺帽的试管中，提取脂肪酸。鉴定结果通过专化的微生物鉴定系统软件-美国MIDI 公司开发的基于细菌细胞脂肪酸成分鉴定细菌的MIS4.5(microbialidentification system)和LGS4.5(librarygenerationsoftware)获得。把分析结果与数据库中储存的 标准菌种的脂肪酸信息进行比对。FAME鉴定结果匹配程度遵循Buyer等的原则:相似性系数 <0.2，结果不可用;相似性系数2 0.2，鉴定到属;相似性系数2 0.5，鉴定到种。
[0052]脂肪酸测定结果表明，SX-3菌株与多粘类芽孢杆菌(Paenibacilluspolymyxa)相 似指数达0.812 (表3 )，鉴定为多粘类芽孢杆菌。
[0053]表3脂肪酸(FAME)鉴定结果。
[0054]
[0055] 根据形态学特征、16SrDNA序列分析结果和脂肪酸(FAME)测定结果，SX-3菌株被 鉴定为多粘类芽孢杆菌(Paenibacilluspolymyxa)。该菌株已于2015年11月11日保藏于位 于北京的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为:CGMCCNo. 11638。
[0056]实施例3菌株SX-3的发酵培养和拮抗组份的检测
[0057]培养液可选用LB液体培养基，其配方为：胰蛋白胨10g/L，酵母浸粉5g/L，氯化钠 1(^/1，调节口!1为7.0~7.2。
[0058] 50L全自动发酵罐培养:将多粘类芽孢杆菌接种于LB培养液中培养至培养液0D_ 为0.6~0.8，获得种子液;将种子液接种至50L发酵罐中，扩大培养温度宜在28~35°C之间， 培养时间在48~72h之间，通气比为0.4~2:1，转速为300~800rpm，pH宜在6~7.5之间。发 酵培养基为:先将淀粉糊化，再加入到含有酵母粉、蛋白粉、葡萄糖、MgS〇4、KH2P〇4、Ca⑶3的 培养基中，121°C灭菌30分钟。最终菌浓度通常可达1X101()~1X10nCFU/mL。
[0059] 实施例4菌株SX-3对棉花黄萎病的温室盆栽试验
[0060] 盆栽试验共设置3个试验组，2个对照组。每个试验组45个植株作一个处理，每个处 理3个重复。对照组包括对照组1(只接种大丽轮枝菌)和对照组2(接无菌水），各设45个处理 (菌株）。棉花育苗是在温室中进行的，待棉花植株生长到3~4叶期后，将菌株SX-3发酵液稀 释到最适浓度1X1〇7~1X108CFU/mL，浇灌于试验组幼苗根部(60mL/盆），对照组1、2分别浇 灌相同体积的灭菌水。发酵液接种5天后，采用蘸根法接种大丽轮枝菌，即制备丽轮枝菌孢 子悬浮液（1X1〇6孢子/mL)，然后将发酵液处理的植株和对照组1的植株切根处理后在孢子 悬浮液中进行蘸根处理（1小时），处理后植株在相同条件下生长。接菌5天、10天、20天后，观 察症状，并统计病害的严重度和防效。
[0061 ]病害严重度统计方法参见Hanson(JournalofCottonScience，2000,4(4) :224-231)分级标准进行评估，BP:
[0062] 1〇〇 =落叶；
[0063] 80 =叶中脉两边都出现萎黄、坏死、叶缘上卷等黄萎病症状；
[0064] 50 =叶片萎蔫，叶中脉一侧出现萎黄症状；
[0065] 25 =叶片萎蔫，无其它症状；
[0066] 〇 =无症状。
[0067] 病情指数（％ ) =Σ(级值X株数)/(4X总株数）X100
[0068]防治效果（％ )=(对照病情指数-处理病情指数)/对照病情指数X100。
[0069]接种试验结果显示，接种大丽轮枝菌5天后，接种大丽轮枝菌对照组1个别植株上 叶片出现可见轻度萎蔫，而浇灌发酵液的处理组植株无任何症状(见表4)。
[0070] 10天后，接种大丽轮枝菌的对照组植株叶中脉基部出现坏死症状，中脉两侧叶脉 变褐，浇灌发酵液的处理组植株有个别出现叶脉轻度黄化现象。三个处理组植株病情指数 分别为1.67、2.22和1.67,而对照组病情指数达到了 18.33,生防菌防效分别下降为 90.89%、87· 89%和90.89% (见表4)。
[0071] 20天后，对照组植株叶片上症状非常显著，呈现叶片坏死、变黄等症状，部分植株 真叶开始脱落，而浇灌发酵液的处理组植株有个别出现叶脉轻度黄化现象，处理组植株病 情指数分别为2.78、3.89和3.33，而对照组病情指数达到29.44，生防菌防效分别为 90 · 56 %、86 · 78 % 和88 · 69 % (见表4)。
[0072]表4温室盆栽SX-3对棉花黄萎病的防治作用结果。
[0073]
[0074] *处理组1、2、3:接种发酵液和孢子悬浮液;对照组1:仅接种孢子悬浮液;对照组2: 仅接灭菌水。
【主权项】
1. 一种多粘类芽孢杆菌，其特征在于，命名为多粘类芽孢杆菌（Paenibacillus polymyxa)SX-3,保藏号为:CGMCC11638。2. -种包含如权利要求1所述多粘类芽孢杆菌的菌剂。3. 如权利要求2所述的菌剂，其特征在于，所述多粘类芽孢杆菌的浓度优选为IX107~1 X108CFU/mL〇4. 如权利要求1所述的多粘类芽孢杆菌在拮抗大丽轮枝菌中的应用。5. 如权利要求1所述的多粘类芽孢杆菌在防治作物黄萎病中的应用。6. 如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述作物为棉花、向日葵、茄子、番茄、烟草或 马铃薯。7. 如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述作物为棉花。8. 如权利要求7所述的应用，其特征在于，包括以下步骤:在棉花3~4叶期，将含有所述 多粘类芽孢杆菌的菌剂浇在苗床上或对植株灌根处理。9. 如权利要求7所述的应用，其特征在于，将菌剂灌根于已发病植株。
【专利摘要】本发明公开了一种防治作物黄萎病的多粘类芽孢杆菌及其应用，该菌株被命名为多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus？polymyxa)SX-3，保藏号为CGMCC？11638。本发明提供了一种含有所述多粘类芽孢杆菌的菌剂。本发明菌株对大丽轮枝菌孢子萌发及菌丝生长都有抑制效果，具有高效拮抗作用。本发明菌株能用于大丽轮枝菌引起的作物黄萎病的防治，对棉花黄萎病有显著防治效果，盆栽试验防效达到86％以上；且作物发病后期，用包含有本发明菌株的菌液灌根，仍具有明显的治疗效果，所以，本发明菌株作为生物农药应用具有很大的潜力。CGMCC No.1163820151111
【IPC分类】A01G13/00, C12N1/20, C12R1/01, A01N63/00, A01P3/00
【公开号】CN105462881
【申请号】CN201510929269
【发明人】张敬泽, 李晓林, 祝水金
【申请人】浙江大学
【公开日】2016年4月6日
【申请日】2015年12月14日