K至50ml离心管。
[0047] (2)加 3ml血浆至离心管。
[0048] (3)加 2.4ml carrier-ACL mix至离心管，盖好管帽，祸旋振荡30s混勾。
[0049] (4)将离心管放到水浴箱中60°C孵育30min。
[0050] (5)从水浴箱中取出离心管，旋开管盖。加入5.4ml ACB缓冲液至离心管，关闭管 盖，涡旋震荡20s，充分混匀。
[0051] (6)将离心管置于冰上孵育10min。由于荧光实时定量PCR需要参照，血清循环RNA 检测过程中无公认可靠的内参基因（管家基因），因此我们选择往3ml血浆中加入lng无关质 粒pGL3 (购自Promega公司）作对照。
[0052] (7)采用真空抽吸方法纯化血清核酸(包括血清中的RNA及加入的pGL3质粒DNA): 组装好20ml延长管，mini柱和真空连接器，打开真空栗，待到全部裂解液通过mini柱(约10 分钟），关闭真空栗，将压力释放到〇,卸下并丢弃延长管。
[0053] (8)加600ul ACW1缓冲液到mini柱，维持mini柱盖子呈打开状态，打开真空栗，待 到ACW1完全通过mini柱，关闭真空栗，将压力释放到0。（第一遍洗涤，去除杂质，纯化mini膜 上的核酸）
[0054] (9)加750ul ACW2缓冲液到mini柱，维持mini柱盖子呈打开状态，打开真空栗，待 到ACW2完全通过mini柱，关闭真空栗，将压力释放到0。（第二遍洗涤，去除杂质，纯化mini膜 上的核酸）
[0055] (10)加750ul 100%乙醇至mini柱，维持mini柱盖子呈打开状态，打开真空栗，待 到乙醇完全通过mini柱，关闭真空栗，将压力释放到0。（第三遍洗涤，去除杂质，纯化mini膜 上的核酸）
[0056] (11)关闭mini柱的盖子，将mini柱卸下来，丢弃连接器，将mini柱放到干净的2ml 收集管，20，000x g离心3min。（去除残留的乙醇）
[0057] (12)将mini柱放到一个新的2ml收集管，打开管盖，放到水浴箱中56°C孵育lOmin， 直到mini膜完全干燥。将mini柱放到一个干净的1.5ml洗脱管，丢弃上一步的2ml收集管，加 入20ul AVE缓冲液(不含carrier RNA)至mini膜的中央，关上盖子，室温孵育3min。20，000x g离心lmin，洗脱纯化的核酸。
[0058] lyg RNA经逆转录成cDNA后，进行实时荧光定量ΡΟ^ΜΧ：284454正向引物为5'-ATCCCCAACTCTGCAACTGG-3 ' 如SEQ Ν0:6所示，和反向引物5 ' -ACACAGCTGGCTTCCCTTTT-3 ' 如 SEQN0:7**。
[0059] 用于对照的质粒pGL3中萤火虫荧光素酶基因的正向引物为
[0060] 5 ' -TCCATCTTGCTCCAACACCC-3 ' 如SEQ N0:8所示，和反向引物
[0061 ] 5 ' -TCGTCTTTCCGTGCTCCAAA-3 '，如SEQ N0:9所示。
[0062] 进行反转录得cDNA，取cDNA为模板，加入SEQ ID N0:6、7、8、9所示的引物以及PCR 反应液，进行PCR扩增，检测样本阈值Cq;同时，pGL3质粒DNA液10倍梯度稀释，作为校对样 本，在每个PCR反应板中进行检测，记录Cq值；内参pGL3质粒PCR扩增；
[0063]实时荧光定量PCR反应体系 iTaq1 vl Universal SYBR? Green Super Mix 5 μL PCR Forward Pri.mer ?'ΙΟμηι.) 0.5μL PCR Reverse Primer < lOum) 0.5μΙ
[0064] cDNA 模板 2.0μΙ dH20 2 μL Total 10 μΙ
[0065] 实时荧光定量PCR反应步骤 1 9SV 30 see 2 95 V 5 sec
[0066] 3 60Γ 30 see 4 Go to stop 2 (or more 35 limes 5 Perform melting curve from 55.0 C lo 95.0'C , read every 0.2'C , hold for 1 see
[0067] 制作标准曲线:上述检测完成后，拷贝数以10为底取对数作为横坐标，Cq值为纵坐 标作图，绘制标准曲线，计算斜率S，然后根据公式E = 10(_1/s)-l，计算扩增效率E;
[0068] 计算:选中样本和校对样本检测孔，应用实时荧光定量PCR仪的随机软件得出样本 阈值Cq(T)和校对样本阈值Cq(C)，根据公式Q=(E+lΓ Λeq，ΛCq=[Cq(T)-Cq(C)]，得出基因 的校正起始拷贝数Q;将L0C284454的Q值与pGL3质粒的Q值的几何平均数相比，得到 L0C284454的相对表达量，采用unpaired t-test检验计算P值。
[0069] 2.结果
[0070] L0C284454在正常人血清中不表达或者表达很低，而在鼻咽癌患者血清中高表达P 〈0.001(图2)。
[0071]实施例3,原位杂交检测发现L0C284454在鼻咽癌中的表达与患者预后相关
[0072] 1.材料方法
[0073] 1.1设计并合成杂交探针
[0074]为了采用原位杂交方法检测L0C284454的表达情况，我们设计了针对原位杂交检 测L0C284454表达的寡核苷酸探针及阳性对照两组原位杂交寡核苷酸探针各3条。
[0075]用于原位杂交检测L0C284454表达的寡核苷酸探针：
[0076] L0C284454探针1:5 ' -GACCGGAAAATAACAAACAAAAACTCTGCCTCAG-3 ' 如SEQ N0:10所 示，
[0077] L0C284454探针2:5 ' -GTGATAGAACTTTAGTCTACCCTCCTCCGAAAAA-3 ' 如SEQ NO: 11所 示，
[0078] L0C284454探针3:5'-GTACAGACAACAAGTTCATTTATTTTCAACGGGAC-3'如SEQ N0:12所 不。
[0079]阳性对照探针(检测看家基因 GAPDH):
[0080] GAPDH探针1:5，-CCACTTTACCAGAGTTAAAAGCAGCCCTGG-3，，如SEQ N0:13所示，
[0081 ] GAPDH探针2:5，-CAGTAGAGGCAGGGATGATGTTCTGGAGAG-3，，如SEQ N0:14所示，
[0082] GAPDH探针3:5，-GTCAGAGGAGACCACCTGGTGCTCAGTGTA-3，，如SEQN0:15所示。
[0083] 采用化学合成方法合成上述设计的各基因特异性寡核苷酸探针序列。
[0084] 1.2寡核苷酸探针标记试剂盒和原位杂交检测试剂
[0085] 地高辛寡核苷酸加尾试剂（Dig Oligonucleitide Tailing Kit 2nd Generation， Roche公司），抗地高辛-辣根过氧化物酶复合物检测试剂盒(Anti-Digoxigenin-P0D，Fab fragments，Roche公司），增强原位表达检测信号的TSA信号放大系统（TSA? Biotin System，NEL700试剂盒，PerkinElmer公司），DAB染色试剂盒(北京中山公司），20x柠檬酸钠 缓冲溶液（saline sodium citrate，SSC)，硫酸葡聚糖(Dextran sulphate)，去离子甲酰胺 (Deionized Formamide)，多聚腺苷酸（polyadenylic acid，Poly A)，多聚脱氧腺苷酸 (polydeoxyadenylic acid，Poly dA)，变性剪切的娃精DNA(denatured and sheared salmon sperm DNA，ssDNA)，酵母转运RNA(yeast t_RNA，tRNA)，二硫苏糖醇（DTT)，50x邓罕 氏缓冲液(Denhardts's solution)，磷酸缓冲液(PBS buffer)，胃蛋白酶K，牛血清白蛋白 (BSA)，三乙醇胺（TEA)，TNB Buffer(0.1M Tris-HCl，pH7.5,0.15M NaCL，0.5%Blocking Reagent)，TNT Buffer(0.1M Tris-HCl，pH7.5,0.15M NaCL，0.05%Tween 20)，醋酸酐，阻 断试剂（Blocking reagent agent，Roche公司）。
[0086] 1.3其他主要试剂和材料
[0087] 无水乙醇、90 %酒精、70 %酒精、50 %酒精、松节油、双蒸水、PBS缓冲液(pH7.2~ 7 · 4，NaCl 137mmo 1 /L，KC1 2 · 7mmo 1 /L，Na2HP〇44 · 3mmo 1 /L，KH2PO41 · 4mmo 1 /L); 3 % 甲醇-双 氧水溶液(80%甲醇和30%双氧水配置）；0.01mol/L柠檬酸盐缓冲液(citrate buffer，CB， ?册.0±0.1，911110.说柠檬酸溶液和4111110.謂梓檬酸钠溶液加入4501111蒸馏水中临时配置 后再校正工作液pH值）；0.1 %胰蛋白酶;苏木素；1 %盐酸酒精（1ml浓盐酸+99ml 70 %酒精 配置）；封片胶(PTS Cure 1〇111^11);专用盖玻片（480\24〇1111112)定制于郑州玻璃仪器厂。 Leica低熔点（58°C)石蜡，国产蜂蜡，无水酒精，二甲苯，10%中性多聚甲醛(0.01m〇l/L， pH7.4，DEPC双蒸水和PBS缓冲液配制），苏木素，伊红，中性封片树胶，盖玻片，载玻片。
[0088] 1.4标记探针
[0089] 利用3-tailing DIG Olignucleutide Kit进行寡核苷酸探针标记，反应体系如 下。
[0090] lOOpmol oligonucleotide+ddH2〇 = 9yl(control: control oligonucleutide 5μ l+ddH20 4μ1) Reaction buffer 4μ1 Cocli 4μ1
[0091 ] Dig-dUTP ΙμL dATP 1μ1 Terminal transferase ΙμL
[0092] 混匀，稍离心。37°C水浴反应30min，加2μ1 EDTA(0.2M，PH 8.0)中止反应。
[0093] 1.5寡核苷酸探针标记后纯化
[0094]为了增加标记探针的纯度，需对已标记的探针进行纯化，具体操作如下：
[0095] 1)探针反应混合物（22μ1)+2·5μ1 4M LiCL+75yl 100%冷乙醇（_20°C).
[0096] 2) -70°C 沉淀 60min，or-20°C2h。
[0097] 3)13.000Xg 4°C离心15min。
[0098] 4)弃上清，用50μ1冰冷的70% (V/V)乙醇洗涤。
[0099] 5)13.000xg 4°C，离心5min。
[0100] 6)弃上清，真空4°C干燥。
[0101 ] 7)用无菌双蒸水重溶探针。
[0102] 1.6原位杂交检测存档石蜡切片中L0C284454的表达
[0103]石蜡切片杂交前处理
[0104] 1)4°C保存的石蜡切片置于58°C烤片30min，熔化表面石蜡。
[0105] 2)二甲苯依次脱蜡3X5min。
[0106] 3)梯级酒精洗涤，100% 酒精 2X2m