in-95% 酒精 lX5min-70% 酒精 lX5min- 50%酒精lX5min4DEPC水洗涤2X3min4DEPC-PBS洗涤2X5min。
[0107] 4)滴加300μ1胃蛋白酶K(10μg/ml)于切片上，37°C消化20min。
[0108] 5)切片入PBS(0.1M PBS+2mg/ml谷氨酸)洗涤lmin，中止反应。
[0109] 6)切片入0.2N HCL，于37°C反应20-30min，增加组织的通透性。
[0110] 7)切片用4%多聚甲醛(0.1M PBS溶解)后固定10min，室温。
[0111] 8)为了增加组织阳性杂交强度，对切片进行乙酰处理。切片入0.25 %乙酸酐 BufferI(0.1M 三乙醇胺），室温 lOmin。
[0112] 9)1M PBS洗涤2X5min。
[0113] 预杂交和杂交
[0114] 预杂交:-20°C保存的预杂交液，先置于37°C孵育60min，预杂交液的用量为50μ1， 石蜡膜履盖切片，37°C湿盒中预杂交2小时。（预杂交液成份包括：2XSSC，10%DeXtran sulphate,IX Denhardt's solution,50mM Phosphate Buffer(PH 7.0),50mM DTT,250yl, 100μg/ml poly A,5μg/ml poly dA,250μg/ml yeast t-RNA,500μg/ml ssDNA,47% Deionized formamide)〇
[0115] 1)移去石蜡膜，甩掉预杂交液，切片置于2XSSC中5min。
[0116] 2)杂交反应：37°C杂交过夜（18-20h)。每一切片加入250μ1杂交液并用石蜡膜履 盖。预杂交液中加入相应的探针就成为杂交液。杂交液在预杂交时配制，放置37°C孵育，使 探针充分溶解于杂交液中，本实验用多条寡核苷酸探针混合，按每一探针500ng/ml浓度配 制成探针杂交液。地高辛加尾标记试剂盒标记探针浓度计算依据:每一探针的浓度按其与 阳性定量探针时检测反应时显色进行比对和lOOpmol 30个碱基的裸探针标记反应理论探 针产量为900ng两种标准进行综合计算出标记探针的浓度。
[0117] 3)杂交后洗涤，切片浸入2 X SSC，10min，揭去石蜡膜。依次于摇床上摇动洗涤，2 X SSC(0.5%SDS)，2X15min-0.25XSSC(0.5%SDS)，2X15min。
[0118] 杂交后显色检测反应
[0119] 1)采用Anti-Digoxigenin-POD检测地高辛探针与mRNA结合复合物;TSA放大系统 增强原位杂交反应显色反应的阳性信号，DAB显色。
[0120] 2)切片转至TNT缓冲液中，3X5min。
[0121] 3)滴加 TNB 阻断缓冲液，300yl/TMAs，室温，30min。
[0122] 4)吸去多余阻断剂，1:100稀释的Anti-Digoxigenin_P0D(TBS+0· 1 %Triton X-100+1 %阻断剂），室温4小时。
[0123] 5)TNT Buffer(0.1M Tris-CL，pH7.5,0.15M NaCL，0.05%Tween 20)洗涤， 3x5min〇
[0124] 6)切片上滴加信号放大试剂Biotinyl Tyamid，300yl/TMAs，（Biotinyl Tyramid 贝士存液:Biotinyl Tyramid溶解于0.2ml DMS0，Biotinyl Tyramid工作液：1X稀释液，1:50 稀释Biotinyl TyramidlC存液），室温10分钟。
[0125] 7)了町洗，3\511^11。
[0126] 8)切片滴加 SA-HRP(链霉卵白素-辣根过氧化物酶），300yl/TMAs，室温30min。
[0127] 9)丁町洗，3\511^11。
[0128] 10)蒸溜水洗涤，lXlmin。
[0129] 11)DAB显色，显微镜下控制显色反应。
[0130] 12)苏木素复染，
[0131] 13)酒精梯级脱水，切片干燥。
[0132] 14)滴加封片胶，相应规格的盖玻片盖片，紫外灯下交联切片lmin。
[0133] 1.7结果判断及标准
[0134] 应用光学显微镜分别在低倍和高倍镜下进行观察，首先观察目标RNA的阳性表达 信号在观察目标细胞内的定位:位于细胞核、细胞浆或细胞膜。
[0135] 再分别以该检测RNA表达部位阳性信号的强度和阳性表达的细胞数两种标准进行 综合评分，判断标准为：（1)依据阳性细胞染色强度判断:a.细胞无染色，记0分;b.细胞染成 浅棕色为弱阳性，记1分;c.细胞染成棕色且无背景着色，或细胞染成深棕色并有浅棕色背 景为中等阳性，记2分;d.细胞染成深棕色且无背景着色为强阳性，记3分。（2)依据阳性细胞 表达数计分:a.无阳性细胞表达，记0分;b.阳性表达细胞数< 25%，记1分;c. 25% <阳性细 胞数<50 %，记2分;d.阳性表达细胞数2 50 %，记3分。
[0136] 为了尽量降低评分结果的主观因素，由两位病理学专家分别按上述标准之一各自 进行判断和评分，再将两者评分相乘，结果为:①〇分者最终计为〇分，认为阴性表达;②1分 和2分者最终计为1分，认为弱阳性表达;③3分和4分者最终计为2分，认为中等阳性表达;④ 6分到9分者最终计为3分，认为强阳性表达。
[0137] 1.8分析和统计软件
[0138] 应用SPSS13.0统计软件对实验结果进行统计学分析，两两比较用x2test或Fisher exact test，相关性分析采用Spearmen correlation方法;P<0.05即差异有统计学意义。 生存曲线分析采用Kaplan-Meier method及log-rank test;多变量分析采用Cox's proportional hazards model ;Ρ<0·05即差异有统计学意义。
[0139] 2 结果
[0140] 2.1L0C284454在鼻咽癌中的表达比正常对照组织中的表达显著升高
[0141] L0C284454在79.5%的鼻咽癌组织中（79/112例)有表达，而仅在17.6% (34例慢性 炎症上皮组织样本中的6例）的正常鼻咽上皮组织中有表达（图3)，两者之间具有明显的统 计学差异(P〈〇.〇〇l)。
[0142] 2.2L0C284454高表达的鼻咽癌患者预后较差
[0143] 我们对112例鼻咽癌患者进行了电话随访，详细询问了他们的首发时间、治疗情 况、有无复发、有无再患其他疾病、复发及死亡时间等，并登记了生存时间和状态，并对鼻咽 癌组织中L0C284454的表达与病人的生存时间和状态进行的生存分析，发现L0C284454高表 达患者总的生存时间和无病生存时间均明显短于L0C284454低表达或不表达的患者（图4)。 说明L0C284454是一个与鼻咽癌预后相关的分子标记，该IncRNA表达高，病人预后差。
[0144] 实施例4，构建shRNA载体干扰L0C284454的表达
[0145] 1.材料方法
[0146] 1.1试剂及试剂盒
[0147] 限制性内切酶Hind III、Bgl II、EcoR I及Cla I，T4DNA连接酶等购自TakaRa公 司；
[0148] TRIZ0L? Reagent(Invitrogen)；
[0149] 质粒抽提试剂盒(#D6943-01，0MEGA);
[0150] 胶回收试剂盒(#M5212,0MEGA);
[0151]逆转录试剂盒(#A3500，Promega);
[0152] 抗生素 G418(Ameresc)。
[0153] 1.2shRNA 的设计
[0154] 首先将L0C284454序列输入Invitrogen公司的Block-It RNAi designer软件，寻 找该IncRNA的shRNA最佳靶点，挑选最佳的3条相应的靶点序列如下：
[0155] shRNA-l:GACTCAGAATCAGACCTGTGI^nSEQN0:16K*，
[0156] shRNA-2:GCATAGATAGGTGGGTGAGTG如SEQN0:17所示，
[0157] shRNA-3:GACACAAGCAGGTGTGCTTAG如SEQN0:18所示，
[0158] 以广泛使用的在人类基因组中没有任何靶点的Scramble序列作为阴性对照，其序 列如下：
[0159] Scramble:5'-GACACGCGACTTGTACCACHnSEQN0:19K*。
[0160] 针对这3条lncRNA^^序列，及Scramble序列，根据OligoEngine公司pSUPER载体 说明书，设计可形成发夹结构的寡核苷酸单链及其反向互补序列，它们退火后即可形成两 端分别带限制性酶切位点Bglll和Hindlll粘性末端的DNA双链。具体需合成的各条寡核苷 酸序列及它们配对退火后形成的DNA双链如下：
[0161] shRNA-Ι：
[0162] 5'-GATCCCC GACTCAGAATCAGACCTGTGT TTCAAGAGA ACACAGGTCTGATTCTGAGTC TTTTTA-3'
[0163] 3'-GGG CTGAGTCTTAGTCTGGACACA AAGTTCTCT TGTGTCCAGACTAAGACTCAG AAAAATTCGA-5，
[0164] 如SEQ NO:20、21所示，
[0165] shRNA-2：
[0166] 5'-GATCCCC GCATAGATAGGTGGGTGAGTG TTCAAGAGA CACTCACCCACCTATCTATGC TTTTTA-3'
[0167] 3'-GGG CGTATCTATCCACCCACTCAC AAGTTCTCT GTGAGTGGGTGGATAGATACG AAAAATTCGA-5，
[0168] 如SEQ NO:22、23所示，
[0169] shRNA-3：
[0170] 5'-GATCCCC GACACAAGCAGGTGTGCTTAG TTCAAGAGA CTAAGCACACCTGCTTGTGTC TTTTTA-3'
[0171] 3'-GGG CTGTGTTCGTCCACACGAATC AAGTTCTCT GATTCGTGTGGACGAACACAG AAAAATTCGA-5,。
[0172] 如SEQ N0:24、25所示，
[0173] Scramble
[0174] 5'-GATCCCC GACACGCGACTTGTACCAC TTCAAGAGA GTGGTACAAGTCGCGTGTC TTTTTA- 3，
[0175] 3'-GGG CTGTGCGCTGAACATGGTG AAGTTCTCT CACCATGTTCAGCGCACAG AAAAATTCGA-5，
[0176] 如SEQ NO:26、27所示。
[0177] 两条互补配对的DNA退火后，左边是限制性内切酶Bgl II的粘性末端，右边是Hind III的粘性末端。
[0178] 1.3shRNA 载体构建
[0179] 化学合成上述4个shRNA对应的8条单链oligo序列，将合成好的oligo用oligo annealing buffer溶解成20μΜ，互补单链各取10μ1混合。然后将oligo混合物在PCR仪中95 °C加热5分钟，然后自然冷却至室温，形成